1樓：法師藥材店
如果樓主指的是人類基因組計劃，那時用的方法叫做雙脫氧終止法，也叫做sanger法。它的原理是在dna合成過程中，dna聚合酶能夠使用ddntp(雙脫氧核苷酸）來作為原料，但它的反應會在加入ddntp的時候終止。具體實驗是通過pcr來完成的，但與普通pcr不同，它只需要一個引物而不是一對。
在4個相同的反應體系中分別加入普通的dntp以及4種不同的ddntp（比如體系1裡面缺少datp，而有ddatp,以此類推）。假設四個體系中分別加入的是ddatp, ddgtp, ddctp和ddgtp我們就分別把這個叫做a，g，c，t體系，然後每個體系中，會在遇到相應鹼基的時候停止反應，這樣就產生了一系列長度不一併且分別在以a,g,c,t時終止的dn**段，比如a體系中的dn**段，都是以a結尾的dna 。接著我們拿著這些片段去進行一個高解析度的電泳（能夠區分出一個鹼基的差別)，然後根據電泳結果，我們就能讀出序列了。
最早的測序方法就是這樣，但是這種方法極其費時間，它需要首先將dna打斷成無數合適的小片段，然後再在完成測序後將其拼接起來。這就是為什麼當時人類基因組計劃需要那麼多國家合作並且耗費那麼多時間的原因。
當然，現代的第二代dna測序技術已經普及了，它們相比第一代測序技術而言，具有低成本，高通量，短耗時等優點。如果用第二代dna測序技術去完**類基因組測序的話，現在最多也就耗時一個月左右。
2樓：匿名使用者
那時還是12年前，用的sanger法，6國合作的。成本極高。現在基本用hiseq，454了。sanger只是輔助和驗證。組裝軟體也非常的多。雜體的組需要建文庫輔助wgs
建議看這方面文章。
求高手指導dna測序實驗怎麼做具體步驟是怎樣的
3樓：
歷史是 rober holley，2023年發表於science雜誌上的文章報道了酵母丙氨酸trna序列，77鹼基。 吳瑞博士（dr. ray wu）提出引物-延伸的測序策略。
2023年首次成功的測定了λ噬菌體的兩個粘性末端。 f.sanger，2023年，發表在nature和pnas上的文章描述了雙脫氧鏈終止法。
諾貝爾獎獲得者。 a.m.
maxam和w.gilbert，2023年，化學法測序。 雙脫氧鏈終止法測序（又稱酶法，sanger測序方法）：
對dna進行體外合成時，將ddntp與dntp按一定的比例混合就可以得到一組大小不同、按照模板序列終止的dn**段 如果引物是帶有標記的，在變性凝膠上做電泳分離，通過放射自顯影技術就可以檢測單鏈dn**段，並進行認讀 化學法dna測序（又稱maxam-gilbert法） 是一個dna化學降解的過程，而不是生物合成過程。 化學試劑處理具有末端標記的dn**段，造成鹼基的特異性切割，由此產生一組具有各種不同長度的dna鏈的反應混合物。 經凝膠電泳按大小分離和放射自顯影后，根據x光片所顯現的相應條帶，直接讀出待測dn**段的核苷酸順序。
ps:呵呵，我是說的最主要的小片段測序法，如果要是測比較大的序列，像人類基因組那類，我記得聽楊煥明教授說他們是用的鳥槍法，呵呵，要針對具體的實驗去選擇方法
基因測序的步驟是什麼？
4樓：匿名使用者
pcr產物直接測序技術現已成為分子生物學和基因組學研究中的一個重要技術，廣泛用於基因突變檢測、遺傳性疾病診斷、單核苷酸多型性研究、基因組重疊序列群等。與傳統克隆測序技術相比較，直接對pcr擴增的dna進行測序，省去了耗時的克隆步驟，避免了傳統的細菌培養，模板提取等重複性操作，可以從少量的原始樣品中得到正確的dna序列資訊。pcr產物直接測序技術具有快速、簡便、穩定經濟的優點。
試驗試劑
pcr擴增的雙鏈dna模板
長約20個核苷酸的dna引物
dna聚合酶
測序膠0.1mol/l ddt
α-32p-datp
dntp/ddntp混合物(80μmol/l/8μmol/l)
dntp(dctp、dgtp 、dttp 各0.75μmol/l)
測序反應緩衝液：40mmol/l tris-hcl(ph7.5)，20mmol/l mgcl2，50mmol/l nacl
終止緩衝液：95% 甲醯胺，20mmol/l edta，0.05% 溴酚藍，0.05% 二甲苯腈
試驗步驟：
1、 4個微量離心管中各加入dntp/ddntp混合物2.5μl，混合物37oc溫浴5min，備用。
2、 在一個空的微量離心管中加入1pmol的pcr擴增雙鏈dna，10pmol測序引物，2μl 5×測序緩衝液，加雙蒸水至總體積10μl，96oc加熱8min，冰浴泠卻1min，4oc 10000g離心10s。
3、 加入2μl預冷的標記混合物(dctp、dgtp 、dttp 各0.75μmol/l)，α-32p-datp 5μci，1μl 0.1mol/l ddt，測序酶2u，加水至15μl，混勻後置冰上2min，標記新合成的dna鏈。
4、 在第1步驟的4個管中各加入3.5μl標記反應混合物，37oc溫浴5min。每管各加入4μl終止液。
5、 樣品在80oc的水浴中熱變性5min，每一泳道加2μl 加到測序膠上，電泳分離這些片段。
注意事項：
1.??pcr產物要有一定的長度(>200bp)，因為測序結果兩端20-30bp的電泳峰圖的準確性較低。
2.??純化pcr產物可通過離子交換層析使擴增的dna段與反應剩餘的dntp及引物分離；也可通過瓊脂糖凝膠電泳,將pcr產物與非特異性擴增產物和引物分離開來；如果擴增的特異性較高時，可直接通過酚：氯仿抽提，乙醇沉澱的方法來純化。
3.??測序引物設計原則類似於pcr引物設計，可在dna合成儀上合成20個左右的核苷酸作為引物，經過高壓液相層析或聚丙烯醯胺凝膠電泳純化後，即可用作測序引物。
pcr迴圈測序法
pcr迴圈測序法是將pcr擴增和核酸序列分析技術相結合，從而形成的一種測定核苷酸序列的研究方法，也稱作線性擴增測序。該方法採用pcr儀加熱使dna模板變性，在taqdna聚合酶作用下，以溫度迴圈模式在模板上進行多輪的雙脫氧核苷酸測序反應，線性擴增標記的dna分子。
pcr迴圈測序法與以往的測序方法相比，其優點在於：大大減少所需的模板量；能提高測序反應產生的訊號，降低了操作的複雜性，且聚合酶的用量減少；可在小量製備的模板上進行篩選反應；高溫下進行的測序反應使dna聚合酶催化的聚合反應能夠通過模板二級結構的區域；雙鏈閉環dna可以直接作為反應模板應用，不用作預先鹼變性處理。由於pcr迴圈測序法能夠簡單、快速地檢測特定序列，因此, pcr迴圈測序法在核酸序列分析研究中受到廣泛的重視。
試驗試劑：
dna測序試劑盒
dntp
ddntp
丙烯醯胺
雙丙烯醯胺
尿素temed(n，n，n『，n』-四甲基乙二胺)
過硫酸銨
6%測序膠：6%丙烯醯胺，7mmol/l 尿素，1×tbe。
10×測序緩衝液：100mmol/l tris-hcl(ph8.8)，500mmol/l kcl，40mmol/l mgcl2，0.
01%明膠，20μmol/l datp，50μmol/l dctp，50μmol/l dgtp，50μmol/l dttp
終止混合液：ddatp (600μmol/l)，ddctp (600μmol/l)，ddgtp (100μmol/l)，ddttp(1000μmol/l)
終止緩衝液：95%甲醯胺，20mmol/l edta，0.05%溴酚藍，0.05%二甲苯腈
試驗步驟
1、 4個小離心管，每個小管加入3μl的終止混合液，將管子放在冰上。
2、 在dna模板中加入引物(4pmol)， 4μl 10×測序緩衝液， 10μlα-32p-datp, 2u taqdna聚合酶，加雙蒸水到30μl徹底混勻，每管7μl加入上面4個小管中。
3、 反應液上加30μl的石蠟油。
4、 95oc 30s，50oc 30s，72oc 60s共30個迴圈，可根據具體的情況進行適當的調整迴圈條件及迴圈次數。
5、 反應結束後在油層下加入5μl的終止緩衝液並用加樣槍混勻。
6、 上樣前將樣品在大於80oc的水浴中熱變性5min，每一道加2μl加到測序膠上，電泳分離這些片段。
注意事項：
1、 製備測序模板：pcr 擴增的產物可以經過低熔點的瓊脂糖凝膠電泳純化**後，用於序列分析；可經過柱層析純化，去除pcr 反應後剩餘的dntp和引物後，用於序列分析。pcr 產物也可不經純化直接用於測序，但是這種測序產生的結果較差，建議測序之前應進行pcr產物的純化。
各種標準的質粒製備方法所純化出的質粒均可作為測序模板使用。用標準方法制備的m13噬菌體、粘粒、λdna都適合用作測序模板用。但要注意的是反應體系中不應有與引物互補的非目的基因序列，否則將會導致測序實驗的失敗。
2、 測序引物：測序引物是指合成的與測序模板鏈特異性互補的寡核苷酸序列。可用α-32p-datp和t4多聚核苷酸激酶對引物的5『端進行標記，反應體系中引物、激酶和α-32p-datp要保持在最佳的比例，以得到高比活性的標記引物；也可用α-32p-datp標記新合成的dna鏈。
引物的濃度不宜高，否則容易形成引物二聚體，或產生非特異性的擴增引物。
3、 酶：各種缺乏3『—5『端外切活性的耐熱dna聚合酶都可以用於迴圈測序，其中taqdna聚合酶在dna測序中最為常用。雖然應用pcr迴圈測序法能夠簡單、快速的進行基因序列的測定，但仍未能適應大規模dna序列測定的需要，而pcr迴圈測序法、熒游標記和自動測序儀的聯合使用成為大規模基因組測序的主要技術。
該技術是採用熒游標記引物或雙脫氧核苷三磷酸，反應產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳後，經特定的dna序列分析儀和分析系統處理待測的dna序列。它的應用減輕了dna序列測定的工作量，提高了測序的效率。
簡述人類基因組計劃的進展情況及人類基因組計劃的意義
人類基因組計劃 hgp 於1985年由美國科學家率先提出 1990年正式啟動 耗資30億美元 目標是為30億個鹼基對構成的人類基因組精確測序，從而最終弄清楚每組基因製造的蛋白質及其作用。2003年完成研究目標。已完成的基因序列圖覆蓋了人類基因組99 的區域，精確率達到了99.99 那是一部長達100...
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