1樓：匿名使用者
pcr技術必須有人工合成的合理引物和提取的樣品dna，然後才進行自動熱迴圈，最後進行產物鑑定與分析。引物設計與合成目前只能在少數技術力量較強的研究院、所進行，臨床應用只需購買pcr檢測試劑盒就可開展工作，pcr自動熱迴圈中影響因素很多，對不同的dna樣品，pcr反應中各種成份加入量和溫度迴圈引數均不一致。現將幾種主要影響因素介紹如下。
一、溫度迴圈引數
在pcr自動熱迴圈中，最關鍵的因素是變性與退火的溫度。如操作範例所示，其變性、退火、延伸的條件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30個迴圈，擴增片段500bp。
在這裡，每一步的時間應從反應混合液達到所要求的溫度後開始計算。在自動熱迴圈儀內由混合液原溫度變至所要求溫度的時間需要30～60s，這一遲滯時間的長短取決於幾個因素，包括反應管型別、壁厚、反應混合液體積、熱源（水浴或加熱塊）以及兩步驟間的溫度差，在設定熱迴圈時應充分給以重視和考慮，對每一儀器均應進行實測。
關於熱迴圈時間的另一個重要考慮是兩條引物之間的距離；距離越遠，合成靶序列全長所需的時間也越長，前文給出的反應時間是按最適於合成長度500bp的靶序列擬定的。下面就各種溫度的選擇作一介紹。
1．模板變性溫度變性溫度是決定pcr反應中雙鏈dna解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產生單鏈dna模板，pcr也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全，dna雙鏈會很快復性，因而減少產量。一般取90～95℃。
樣品一旦到達此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。dna變性只需要幾秒種，時間過久沒有必要；反之，在高溫時間應儘量縮短，以保持taq dna聚合酶的活力，加入taq dna聚合酶後最高變性溫度不宜超過95℃。
2．引物退火溫度退火溫度決定pcr特異性與產量；溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結合，dna擴增效率下降；溫度低產量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產物增加。一般先由37℃反應條件開始，設定一系列對照反應，以確定某一特定反應的最適退火溫度。也可根據引物的（g+c）%含量進行推測，把握試驗的起始點，一般試驗中退火溫度ta(annealing temperature)比擴增引物的融解溫度ttm(melting temperature)低5℃，可按公式進行計算：
ta = tm - 5℃= 4(g+c)+ 2(a+t) -5℃
其中a，t，g，c分別表示相應鹼基的個數。例如，20個鹼基的引物，如果（g+c）%含量為50%時，則ta的起點可設在55℃。在典型的引物濃度時（如0.
2μmol/l）,退火反應數秒即可完成，長時間退火沒有必要。
3．引物延伸溫度溫度的選擇取決於taq dna聚合酶的最適溫度。一般取70～75℃，在72℃時酶催化核苷酸的標準速率可達35～100個核苷酸/秒。每分鐘可延伸1kb的長度，其速度取決於緩衝溶液的組成、ph值、鹽濃度與dna模板的性質。
擴增片段如短於150bp，則可省略延伸這一步，而成為雙溫迴圈，因taq dna聚合酶在退火溫度下足以完成短序列的合成。對於100～300bp之間的短序列片段，採用快速、簡便的雙溫迴圈是行之有效的。此時，引物延伸溫度與退火溫度相同。
對於1kb以上的dn**段，可根據片段長度將延伸時間控制在1～7min，與此同時，在pcr緩衝液中需加入明膠或bsa試劑，使taq dna聚合酶在長時間內保持良好的活性與穩定性；15%～20%的甘油有助於擴增2.5kb左右或較長dn**段。
4．迴圈次數常規pcr一般為25～40個週期。一般的錯誤是迴圈次數過多，非特異性背景嚴重，複雜度增加。當然迴圈反應的次數太少，則產率偏低。
所以，在保證產物得率前提下，應儘量減少迴圈次數。
擴增結束後，樣品冷卻並置4℃儲存。
二、引物引物設計
要擴增模板dna，首先要設計兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實際上就是兩段與待擴增靶dna序列互補的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴增片段的長度，兩引物的5』端決定擴增產物的兩個5』末端位置。由此可見，引物是決定pcr擴增片段長度、位置和結果的關鍵，引物設計也就更為重要。
引物設計的必要條件是與引物互補的靶dna序列必須是已知的，兩引物之間的序列未必清楚，這兩段已知序列一般為15～20個鹼基，可以用dna合成儀合成與其對應互補的二條引物，除此之外，引物設計一般遵循的原則包括：
1．引物長度根據統計學計算，長約17個鹼基的寡核苷酸序列在人的基因組中可能出現的機率的為1次。因此，引物長度一般最低不少於16個核苷酸，而最高不超過30個核苷酸，最佳長度為20～24個核苷酸。這樣短的寡核苷酸在聚合反應溫度（通過72℃）下不會形成穩定的雜合體。
有時可在5』端新增不與模板互補的序列，如限制性酶切位點或啟動因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5』端生物素標記或熒游標記可用於微生物檢測等各種目的。
有時引物不起作用，理由不明，可移動位置來解決。
2．（g+c）%含量引物的組成應均勻，儘量避免含有相同的鹼基多聚體。兩個引物中（g+c）%含量應儘量相似，在已知擴增片段（g+c）%含量時宜接近於待擴增片段，一般以40%～60%為佳。
3．引物內部應避免內部形成明顯的次級結構，尤其是髮夾結構（hairpin structures）。例如：
4．引物之間兩個引物之間不應發生互補，特別是在引物3』端，即使無法避免，其3』端互補鹼基也不應大於2個鹼基，否則易生成「引物二聚體」或「引物二倍體」（primer dimer）。所謂引物二聚體實質上是在dna聚合酶作用下，一條引物在另一條引物序列上進行延伸所形成的與二條引物長度相近的雙鏈dn**段，是pcr常見的副產品，有時甚至成為主要產物。
另外，兩條引物之間避免有同源序列，尤為連續6個以上相同鹼基的寡核苷酸片段，否則兩條引物會相互競爭模板的同一位點；同樣，引物與待擴增靶dna或樣品dna的其它序列也不能存在6個以上鹼基的同源序列。否則，引物就會與其它位點結合，使特異擴增減少，非特異擴增增加。
5．引物3』端配對dna聚合酶是在引物3』端新增單核苷酸，所以，引物3』端5～6個鹼基與靶dna的配對要求必須精確和嚴格，這樣才能保證pcr有效擴增。
引物設計是否合理可用pcrdesn軟體和美國primer軟體進行計算機檢索來核定。
人工合成的寡核苷酸引於最好經過色譜（層析）純化或page純化，以除去未能合成至全長的短鏈等雜質。純化引物在25%乙腈溶液中4℃儲存可阻止微生物的生長；一般情況下，不用的引物應儲存在-20℃冰箱中，在液體中引物能儲存6個月，凍幹後可儲存1～2年。
2樓：匿名使用者
pcr(聚合酶鏈式反應)原理
pcr是體
外酶促合成特異dn**段的方法，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反覆的熱迴圈構成： 即在高溫（95℃）下，待擴增的靶dna雙鏈受熱變性成為兩條單鏈dna模板；而後在低溫（37～55℃）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈dna模板結合，形成部分雙鏈；在taq酶的最適溫度（72℃）下，以引物3』端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以5』→3』方向延伸，合成dna新鏈。這樣，每一雙鏈的dna模板，經過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱迴圈後就成了兩條雙鏈dna分子。
如此反覆進行，每一次迴圈所產生的dna均能成為下一次迴圈的模板，每一次迴圈都使兩條人工合成的引物間的dna特異區拷貝數擴增一倍，pcr產物得以2n的批數形式迅速擴增，經過25～30個迴圈後，理論上可使基因擴增109倍以上，實際上一般可達106～107倍。
3樓：匿名使用者
聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction)，簡稱pcr，是一種分子生物學技術，用於放大特定的dn**段。可看作生物體外的特殊dna複製。
dna聚合酶（dna polymerase i）最早於2023年發現 ，而較具有實驗價值及實用性的klenow fragment of e. coli 則是於70年代的初期由dr. h.
klenow 所發現，但由於此酶不耐高溫，高溫能使之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應。現今所使用的酶(簡稱 taq polymerase), 則是於2023年從 溫泉中的細菌（thermus aquaticus）分離出來的。它的特性就在於能耐高溫，是一個很理想的 酶，但它被廣泛運用則於80年代之後。
pcr最初的原始雛形概念是類似基因修復複製，它是於2023年由 dr. kjell kleppe 提出。他發表了第一個單純且短暫性基因複製（類似pcr前兩個週期反應）的實驗。
而現今所發展出來的pcr則於1983由 dr. kary b. mullis發展出的，dr.
mullis當年服務於pe公司，因此pe公司在pcr界有著特殊的地位。dr. mullis 並於2023年與 saiki 等人正式表了第一篇相關的**。
此後，pcr的運用一日千里，相關的**發表質量可以說是令眾多其它研究方法難望其項背。隨後pcr技術在生物科研和臨床應用中得以廣泛應用，成為分子生物學研究的最重要技術。mullis也因此獲得了2023年諾貝爾化學獎。
［pcr原理］
[編輯本段]
dna的半保留複製是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈dna在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在dna聚合酶與啟動子的參與下，根據鹼基互補配對原則複製成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發現，dna在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。
因此，通過溫度變化控制dna的變性和復性，並設計引物做啟動子，加入dna聚合酶、dntp就可以完成特定基因的體外複製。
但是，dna聚合酶在高溫時會失活，因此，每次迴圈都得加入新的dna聚合酶，不僅操作煩瑣，而且**昂貴，制約了pcr技術的應用和發展。
發現耐熱dna聚合同酶--taq酶對於pcr的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個迴圈加酶，使pcr技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，pcr技術得以大量應用，並逐步應用於臨床。
這是什麼用途，這是什麼？什麼用途
用途，指應用的方面 範圍。一種具有多種用途的工具。詳見郭沫若 洪波曲 第八章 這三筆經費的用途，主要是出於我的主意，故我記得很清楚。1.玻璃的種類越來越多，用途越來越廣。2.豬全身是寶，豬肉可以吃，豬骨 豬皮 豬毛都有用途。3.縣裡勞師動眾地修用途不大的水庫，這很讓人費解。4.服務員向我們說明了產品...
什麼是POS機？它有什麼用途，什麼是POS機 pos機和pos收款機的區別,它有什麼用途
什麼是pos機，pos機是什麼意思？pos point of sales 的中文意思是 銷售點 是一種配有條碼 或ocr碼 optical character recognition 光字元碼 終端閱讀器，有現金或易貨額度出納功能。品種有有線和無線兩種或有 無線兼用。pos機與廣告易貨交易平臺的結算...
花生的用途是什麼，花生有什麼用途？
花生長於滋養補益，有助於延年益壽，所以民間又稱 長生果 並且和黃豆一樣被譽為 植物肉 素中之葷 花生的營養價值比糧食類高，可與雞蛋 牛奶 肉類等一些動物性食物媲美。它含有大量的蛋白質和脂肪，特別是不飽和脂肪酸的含量很高，很適宜製造各種營養 食品。它除可以榨油外，還可以炒 炸 煮食，製成花生酥 以及各...