1樓：鵝子野心
實驗目的
瞭解iptg誘導的外源基因在大腸桿菌中的表達的原理，掌握外源基因在大腸桿菌中的表達及其檢測技術。
實驗原理
將外源基因克隆在含有lac 啟動子的表達載體中，讓其在大腸桿菌中表達。沒有加入iptg誘導劑的時候，laci 產生的阻遏蛋白與lac 操縱基因結合，從而不能進行外源基因的轉錄和表達，而只有表達載體隨大腸桿菌的增殖和複製；當加入iptg後，阻遏蛋白不能與操縱基因結合，則dna外源基因大量轉錄並高效表達。表達的蛋白可以通過sds-page進行初步鑑定。
不同的蛋白質分子具有不同的電荷和分子量。蛋白質在強陰離子去汙劑sds與某一還原劑(如二巰基乙醇)共同作用下並加熱使蛋白質解離後，變性的蛋白質與sds結合並因此而帶負電荷，不同的蛋白質結合sds的量僅與分子量成正比而與氨基酸的序列無關，在sds-page電泳時，蛋白質在聚丙烯醯胺中的遷移率僅僅取決於蛋白質的分子量。
聚丙烯醯胺凝膠電泳由丙烯醯胺單體和交聯劑n，n′—亞甲基雙丙烯醯胺在催化劑作用下，形成三維網狀結構。凝膠電泳不僅具有分辨不同分子量蛋白質的作用(即分子篩作用)，還具有濃縮作用。由於不連續緩衝系統具有把樣品中的sds-多肽複合物全部濃縮於極小體積的能力，從而提高了解析度。
採用考馬斯亮藍快速染色，可及時觀察電泳分離效果。
實驗內容
材料：含有重組表達載體pet-b1, 空表達載體pet28b的大腸桿菌bl21。
試劑：細菌培養用的lb液體培養基，（含50μg/ml的卡那黴素）
lb平板（含50μg/ml的卡那黴素），100mmiptg，
10mg/ml的溶菌酶（10mm tris-hcl，ph8.0配製），
sds-page用試劑及考馬斯亮藍r250
30％(w／v)凝膠貯存液（丙烯醯胺具有神經毒性，操作時要戴手套和口罩）
丙烯醯胺29g，亞甲雙丙烯醯胺1g, 加ddh2o溶至100ml，用新華3號濾紙過濾，棕色瓶中4℃儲存，每隔幾個月須重新配製。
tris-hcl，ph8.8 1．5mol／l
0.5mol／l tris—hcl，ph 6.8。
10％sds。
10％過硫酸銨(ap，新鮮配製)。
temed(四甲基乙二胺)。
tris-甘氨酸電泳緩衝液，ph8.3，可配成5×貯存液備用，臨用前稀釋。
工作液 5×貯存液
tris鹼 25 mmol／l tris鹼 15.1g
甘氨酸 250mmol／l (ph 8.3) 甘氨酸 94g
sds 0.1％ 1％sds 50ml
加ddh2o 至1000ml
樣品處理液
deionized water 3.8 ml
0.5 m tris-hcl, ph 6.8 1.0 ml
glycerol 0.8 ml
10% (w/v) sds 1.6 ml
2-mercaptoethanol 0.4 ml
1% (w/v) bromophenol blue 0.4 ml
染色液 0.4％考馬斯亮藍—r250染色液。
甲醇 400m1
冰乙酸 100ml
考馬斯亮藍r250 1g
ddh2o加至 1000m1
脫色液甲醇 400ml
冰乙酸 100ml
ddh2o 500ml
操作步驟
1將凍存的含有組表達載體pet-b1, 空表達載體pet28b的大腸桿菌bl21畫線接種在lb平板上，37度培養過夜，直至平板上長出單菌落。
2 挑取單菌落至5mllb液體培養基中，培養至od600=0.6左右。4度放置過夜。
3 取2ml培養菌加入到48ml培養基中，繼續培養至od600=0.4-0.6之間。
4 表達載體和重組載體都分別設定誘導組與不誘導組，誘導組加入終濃度為1mm的iptg，不誘導組不加iptg。25度誘導培養12h。
5 取1.5ml培養菌至離心管中，5000rpm離心1分鐘，收集細菌。
6 用1ml 10mm tris-hcl（ph8.0）懸浮細菌，5000rpm離心1分鐘，收集細菌。
7 加入30ul的 10mg/ml的溶菌酶，充分懸浮，4度放置2小時以上。
8 製備4%濃縮膠，12%的分離膠的sds-page膠。
按下表製備濃縮膠
水 6.1
30%丙烯醯胺溶液 1.33
0.5mol／l tris-hcl ph 6.8 2.5
10％sds 0.1
10％ap 0.05
temed 0.01
按下表製備分離膠
外源基因的表達與檢測
9 超聲處理5分鐘，每30秒間隔50秒，12000rpm離心10分鐘，取上清作為蛋白樣品。
10 渠5ul測定蛋白濃度。
11 取50ug蛋白上樣，加入5ul上樣緩衝液，沸水浴5分鐘，瞬時離心後上樣。
12 170v恆壓電泳至溴酚藍至凝膠前沿。
13 染色1小時
14 脫色至條帶清晰，背景明亮為止。
結果： 誘導的pet-b1菌液樣品在分子量61kda處有一明顯的深厚條帶，而其他三種處理沒有此條帶。
影響蛋白質電泳分離效果的因素
1．蛋白質樣品中的鹽濃度 影響蛋白條帶的遷移率和帶型，因此為消除鹽濃度的影響，溶解蛋白時最好用去離子水，再加等量2×sds-page樣品緩衝液，必要時經過透析或進行sephader g25過柱。
2．sds的質量 由於變性蛋白是與sds結合而帶負電荷，蛋白結合sds的量與蛋白質的分子量成正比，因此質量不同的sds，相同的蛋白質樣品，將可能出現不同遷移率的電泳圖譜。
3．上樣孔是否平齊，若上樣孔不平齊，也影響蛋白電泳的遷移率。
4．為防止相鄰泳道樣品的擴散，而導致電泳條帶的不整齊，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×sds樣品緩衝液。
電泳樣品的準備
1．濃度 單一成分1—10μg，若濃度太稀，應沉澱後再進行電泳；對於非單一成分的樣品，如基因工程大腸桿菌的表達產物，其蛋白量50～100μg可取得較好的分離效果。
2．體積 樣品體積儘可能小，以保證電泳條帶的整齊，必要時可應用6×sds加樣緩衝液以增加蛋白質的加樣量。
3．鹽濃度應儘可能低，可用sephaderg25快速脫鹽；鉀離子(k+)要除去，因為鉀離子沉澱sds。
4．分離小分子肽時，分離膠的濃度可提高到20％～25％。
5. 對照孔加入蛋白質分子量標準樣品，同樣也須1000c處理 3～5min。
注意事項
1. 丙烯醯胺單體和交聯劑n，n′—亞甲基雙丙烯醯胺有神經毒性，在稱量和配製時要帶一次性手套，稱量時最好也戴上口罩。
2. 凝固後一般不再有毒性，但考慮到存在沒有完全交連的分子，實驗結束後不宜直接用手拿取，要先用清水漂洗5-10分鐘。
3. 室溫較低時膠液不易凝固，可以在槽中加370c溫水。
4. sds很容易漂浮在空氣中而吸入體內，稱量時最好在通風櫥中進行，或戴上口罩。
5. 在實際操作中，很容易將電極接反，請注意，負極永遠接在加樣孔的一端（即上負下正）
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