1樓：匿名使用者
一些rna提取方法，在進行具體實驗時，應根據研究物件的性質，提取核酸的用途而對上述方法在操作步驟和試劑使用量上作一定的修改。
1、 在核酸提取時，為了增加細胞的裂解度，增加核蛋白複合體破碎度，以釋放更多的遊離核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶k，在確保沒有核酸水解酶存在的前提下，酶反應時間越長越好。
2、 有時在使用蛋白酶時，為了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶緩衝液中用終濃度5mm的edta代替nacl，並且可將反應溫度提高到50－60℃，並將反應時間縮短到15－25min，但酶用量必須提高10－20倍。溶菌酶使用時緩衝液中需加edta，因遊離金屬離子對酶有抑制。
3、 許多植物材料中富含酚，在細胞破碎時，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的錕類物資，影響核酸的提取及降低提取質量，在提取液中加入pvp和巰基乙醇對降低酚類的干撓可能有所幫助。pvp將與酚形成複雜的聚合體，在提取時將酚從核酸成分中游離。且pvp與巰基乙醇作為強還原劑可防止多酚的褐變。
另外作為還原劑的這些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。
4、 許多生物材料在提取核酸時，都會遇到多糖的汙染問題，具體表現為有機溶劑沉澱時，沉澱很多，但復溶時，大量沉澱不溶，電泳觀察時核酸含量很低。
克服多糖汙染可採用以下一些辦法
1) ctab多次抽提。
2) 在有機溶劑沉澱時先稀釋樣品濃度（可到10倍左右），對低濃度樣品再進行沉澱。
3) 在有機溶劑沉澱時選用異丙醇和5mnacl作為沉澱溶劑，此時氯化鈉的用量可用到1/5-1/2的體積，異丙醇可用到0.6-1的體積。異丙醇沉澱核酸時，高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中，從而可達到去多糖的作用。
但高濃度的鹽存在會影響核酸的進一步操作，因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。
5、 在核酸提取時，酚與氯仿均起到變性的作用。酚的變效能力強於氯仿，但酚與水有一定的互溶，因此酚抽後，除可能損失部分核酸外，水相中還會殘留酚，而酚的存在將對核酸的酶反應產生強的抑制，因此在操作中可單用氯仿作變性劑、也可用酚/氯仿混合變性，也可用單一酚作變性己，但用單一酚後在有機溶劑沉澱時一定要用氯仿從抽提。
6、 在操作中當加入變性劑氯仿後，為了保證核酸樣品的完整性，操作要輕，尤其在提dna時，更要避免劇烈操作。
7、 在沉澱核酸時可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強於異丙醇，所以一般用2v乙醇沉澱，但在多糖、蛋白含量高時，用異丙醇沉澱可部分克服這種汙染，尤其用異丙醇在室溫下沉澱對擺脫多糖、雜蛋白汙染更為有效。
8、 在提取核酸時，如樣品濃度低，則應增加有機溶劑沉澱時間，－70℃下》30min;－20℃過夜將有助於增加核酸的沉澱量。
9、 在核酸提取過程中有機溶劑沉澱後復溶時可加水因此時離子濃度可能較高，而到高度純化後低溫儲存時最好復溶於te緩衝液中，因溶於te的核酸儲藏穩定性要高於水溶液中的核酸。另外核酸樣品儲存時要求以高濃度儲存，低濃度的核酸樣品要比高濃度的更易降解。
10、 核酸提取後可通過pcr 、rt－pcr直接擴增出目的基因片斷，也可首先構建文庫、然後由race、dd-pcr等差異顯示技術、aflp等標記技術、差異雜交或文庫扣除技術等方法篩選出特異探針，再用此探針從文庫中篩選出完整基因。
11、 在抽提過程中，若蛋白質含量或其它的雜質還較多，可以增加抽提次數.提取rna請儘量在低溫下操作，如果條件不容許，在室溫下操作的時間要儘可能的短。
rnase汙染的10大**
1：手指頭–手指頭是外源酶的第一**，所以必需戴手套並且頻繁更換。另外，口罩也必需戴，因為呼吸也是一個重要的酶**。戴手套口罩的另外的好處是保護實驗人員。
2：槍頭，離心管，移液器–單純的滅菌是不能滅活rnase的，所以槍頭和離心管要用depc處理，即使是標明為depc處理過的。移液器最好是專用的，用前用75%的酒精棉球搽拭乾淨，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪頭器。
3：水/緩衝液–一定要確保無rnase汙染。
4：實驗檯面–最起碼要用75%的酒精棉球搽拭乾淨。
5：內源rnase–所有組織均含內源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。液氮儲存/碾磨方法的確不方便，但對有一些內源酶含量很高的組織，卻是唯一的辦法。
6：rna樣品–rna抽提產物可能都會含痕量的rnase汙染。
7：質粒抽提–質粒抽提往往用到rnase降解rna，殘留的rnase要用proteinasek消化，pci抽提。
8：rna儲存–即使低溫儲存，痕量的rnase亦會導致rna降解。長期儲存rna的最好辦法是鹽/醇懸液，因為醇在低溫時抑制所有的酶活性。
9：陽離子(ca,mg)–在含這些離子時，80c加熱5分鐘會導致rna被剪下，故如果rna需要被加熱，儲存液需要含螯合劑(1mm sodium citrate,ph6.4)。
10：後續實驗所用的酶–酶均有可能被rnase汙染。
rnase和depc處理
1：高壓滅菌是可以滅活部分rnasea的。實驗證明：
37c與rna反應，沒有滅菌的pbs，活性點為100pg/ml；滅菌後，活性點為100ng/ml。當然，滅菌後rnase仍然不能認為沒有殘留。
2：depc在水中半衰期為30分鐘。0.1%的depc滅菌15分鐘可以認為徹底破壞了depc。破壞後可以聞到一點氣味。
3：在1m tris,1m hepes,1m mops中分別加入1ug/ml rnasea和0.1%及1%depc實驗。
結果提示，0.1%depc只對mops有效，而1%depc對三種試劑都有效。
4：0.01%depc，0.
1%depc，1%depc有效去除rnasea的濃度分別為：100ng/ml，500ng/ml，1ug/ml。但要注意，depc滅活後的副產品，對有些後續實驗是有影響的。
rna抽提的10大竅門
1：快速阻止rnase活性–樣品收集後快速冷凍，裂解時快速操作滅活rnase。
2：選擇合適的抽提方法–高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含苯酚的方法。
3：預判質量要求–northern，cdna文庫構建對完整性要求高，rt-pcr, rpa(ribonucleaseprotectionassay)對完整性要求不是很高。rt-pcr對純度(酶抑制物殘留)要求很高。
4：徹底勻漿是提高得率和降低降解的關鍵。
5：檢查rna的完整性–電泳檢測，28s:18s=2:1是完整的標誌，1:1對大部分實驗也是可以接受的。
6：去除dna–用於rt-pcr,array analysis最好用dnase i去除dna。
7：降低外源酶的汙染–不能從外面又匯入酶。
8：低濃度的核酸濃縮時，要加入助沉澱試劑。但要防止助沉澱劑含酶及dna汙染。
9：徹底溶解rna，必要時可以65c加熱5分鐘。
10：合適的儲存方法–短時間可以–20c儲存，長期請儲存於–80c。
提高rna得率
首先要意識到不同得樣品其rna含量差別很大。高丰度(2-4ug/mg)的如肝臟，胰腺，心臟，中丰度(0.05-2ug/mg)的如腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢，低丰度(<0.
05ug/mg)的如膀胱，骨，脂肪。
1：裂解細胞使rna釋放出來–rna如果不被釋放出來，得率是會降低的。電動勻漿比其它勻漿方法效果更好，但也可能需要結合其它得方法，如液氮搗碎，酶消化(lysozyme/lyticase)
2：抽提方法的優化。基於苯酚的方法的最大問題是分層不徹底和部分rna的丟失(不能全部將上清取出)。
分層不徹底是因為核酸和蛋白質含量高，可以用增加裂解液使用量或者降低樣品量解決。脂肪組織要增加一步氯仿抽提。rna的丟失可以用反抽方法或者去除有機層後再離心的方法降低。
基於柱離心式方法的最大問題是樣品過量。
經典抽提小技巧
1：phenol純化：將等體積的1:
1 phenol/chloroform加入，劇烈混允1-2分鐘。高速離心2分鐘。小心取上清(80-90%)。
決不能取到中間層。可以使用等體積的反應液加入phenol/chloroform中，同樣再取出上清。將兩次的上清混在一起用於核酸沉澱，可以提高得率。
混允時不能太溫和，也不要試圖取出全部上清。
2：70-80%乙醇洗滌：洗滌時，一定要將核酸懸浮起來，才能保證殘留的鹽被洗去。
同時，在倒掉乙醇後，立即高速離心數秒，再用移液器去除殘留的乙醇。室溫靜置5-10分鐘後，溶解。
特殊組織的抽提
纖維組織：心臟/骨骼肌等纖維組織抽提rna關鍵在徹底破碎組織。這些組織細胞密度低，故單位重量的組織rna的含量就少，最好用儘可能多的起始量。一定要在冷凍條件下將組織徹底磨碎。
蛋白/脂肪含量高的組織：腦/植物脂肪含量高，pci抽提後，上清含白色絮狀物。必須用氯仿再次對上清進行抽提。
核酸/核酶含量高的組織：脾/胸腺等核酸和核酶含量很高。在冷凍條件下碾磨組織，再快速勻漿，能有效滅活核酶。
但如果裂解液太粘稠(因為核酸含量高的緣故)，pci抽提不能有效分層；加入更多裂解液可以解決此問題。多次pci抽提可以去除更多殘留的dna。如果加入醇後馬上有白色沉澱形成提示有dna汙染。
溶解後用酸性pci再次抽提，可以去除dna汙染。
植物組織：植物組織比動物組織更為複雜。一般，大家都是在液氮條件下對植物進行碾磨的，所以內源酶作用使rna降解的現象不常見。
如果降解問題不能解決，幾乎可以肯定是樣品中的內含雜質導致。許多植物的內含雜質都會導致殘留，之所以殘留，往往是因為這些雜質與rna有一些相似性：你沉澱我沉澱，你吸附我吸附。
這些特點決定了它們是非常強的酶抑制劑。目前，商品化的rna抽提試劑經過小量調整，可以適合幾乎所有的動物組織，但卻沒有一種商品化的rna抽提試劑，可以適合大部分植物組織。
樣品凍融的影響
冷凍的樣品可能較大，用於抽提rna之前，需要切割。切割過程中樣品往往出現融化(可能是部分融化)。冷凍的樣品抽提rna前可能還要稱重，這個過程肯定會出現融化。
有時候，液氮碾磨過程中也會出現樣品的融化；或者冷凍樣品不經過液氮碾磨直接加入裂解液中，在徹底勻漿前肯定會出現融化。實驗表明，冷凍組織在融化過程中比新鮮組織更容易發生rna的降解。可能的原因是：
凍融過程破壞了細胞內的結構，使內源酶更容易與rna直接接觸。
rna質量的判斷
通常，使用電泳判斷rna的完整性，使用a260/a280判斷rna的純度。理論上，完整的rna擁有28s:18s=2.
7:1的比例，大部分資料則強調28s:18s=2:
1的比例。事實是，除了細胞外，從其它樣品中抽提的rna幾乎都得不到2:1的比例(此結論使用agilentbioanalyzer獲得)。
rna的電泳結果受許多因素的影響，包括二級結構，電泳條件，上樣量，被eb飽和的程度等。使用非變性電泳檢測rna，以dnamarker做對照，如果2kb處的28s和0.9kb處的18s條帶清晰，且28s:
18s>1，該完整性可以滿足絕大部分後續實驗要求了。
a260/a280是一個給大家帶來許多困惑的指標。首先要明確該指標用於核酸的原始含義是：純的rna，其a260/280=2.
0左右。純rna是『因』，a260/a280=2是『果』。現在大家卻在拿a260/a280當『因』用，認為「如果a260/a280=2，所以rna是純的」，自然會產生困惑。
有興趣的話，可以在您的rna樣品中加入一點抽提中經常使用的試劑，如苯酚，異硫氰酸胍，peg等，再測a260/a280比值。現實是，許多抽提rna時使用的試劑，以及樣品中的許多雜質都在a260和a280處附近有吸收，對a260/a280產生影響。目前最具有指導性的做法是：
對rna樣品在200-300nm範圍掃描。純rna的曲線具有如下特點：曲線平滑，a230和a260是兩個拐點，a300接近0，a260/a280=2.
0左右，a260/a230=2.0左右。如果沒有掃描資料，也一定要測定a260/a230比值，因為該比值對所有影響酶反應的雜質的殘留更敏感。
要考慮裝置的線形範圍(a260要處於0.1–0.5之間)。
另外有兩個有用的現象：在水中測定a260/a280，比值將變低0.3左右；而在10mm edta中測定的比值比在1mm edta中測定的高0.
2左右。
rnaguard：抑制組織/細胞內源酶的試劑
綜上所述，確保rna不降解的傳統做法是：在取組織前將含液氮的容器放在手邊，一旦取出所需組織，立即切割小後投入液氮中。抽提前先在碾缽中加入適量的液氮，再將組織從液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾缽中碾磨。
碾磨過程中要及時補充液氮以防止組織融化。待組織徹底碾磨碎後，等待剩餘液氮恰好揮發完時，立即將碾磨碎的組織移入裂解液中快速勻漿......安全的稱重幾乎不可能。
這麼嚴格的操作，是沒有多少實驗人員去認真執行的。
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