qpcr的溶解曲線有多個峰值pcr體系調整

1樓：阿魯巴星人

溶解曲線有多個峰值就說明有非特異性擴增。可以升高退火溫度，或者更換引物。

sybr green pcr溶解曲線有何意義

2樓：壞蛋老公他媳婦

作用類似於電泳，但是相對於電泳更靈敏，更清晰一些。

通過溶解曲線可

以瞭解目的產物tm值，是否出現雜峰。一般溶解曲線的結果+電泳的結果和在一起相對比較準確。當然最後片段也可以測序最終確定目的產物。

主要的是：根據溶解曲線可以確定以下幾點：

a.擴增產物是否單一，即是否含有引物二聚體等其它非目的性產物。如果在90度左右的時候溶解曲線陡然下降，說明產物較純。

b.可以確定產物的tm值，一般在90度以上。

可能用途更多，最常用的主要的兩點就是這兩個了。

針對溶解曲線還有一條相應的曲線，看起來更方便一些。

dna溶解曲線表示擴增產物的特異性。

曲線橫座標是溫度，每個溫度點一個。一般從60到98度縱座標是熒光強度的變化值（不是強度本身）。一開始加熱的時候，雖然熒光強度比較強，但是由於雙鏈沒有解離，所以熒光強度保持不變。

當加熱接近於pcr產物tm時，雙鏈開始解離，熒光強度變小，機器會比較前後2個溫度點的熒光強度，然後把2者的差值標在圖上。tm到達時，有一般雙鏈解離，這時的熒光強度變化最大（峰值）。再加熱，雙鏈全部解離，所以熒光強度的變化又變小了。

pcr產物大小不一，但是只要有相同或者相近的tm，峰值就有可能在一個位置上。如果實際測得的峰值和理論計算的吻合，問題不大。如果有差別，說明有非特異性產物，不要再用sybr green方法。

什麼是realtime-pcr溶解曲線

3樓：匿名使用者

如圖所示，這就是一個標準的real time-qpcr溶解曲線。下面從幾個方面來解讀：1、隨著溫度的升高，dna雙鏈斷裂；接著溫度降低，到達退火溫度的時候，dna雙鏈復性，熒光分子繫結在dna雙鏈上，所以熒光訊號值到達最高點。

上面的是反映在擴增曲線上面的。2、接著dna雙鏈分子由退火溫度約60度，繼續升溫，雙鏈斷開，dna分子溶解。請注意溶解曲線的縱座標，表示單位時間內熒光訊號的變化量。

當擴增產物特異，是單一產物的時候，這個縱座標峰值所對應的橫座標應該是一致的，即呈現單一的溶解峰，這個時候，在同樣的溫度下，可以認為是產物相同；如果溶解峰不單一，就意味有非特異性擴增。

誰能具體解釋一下熒光定量pcr中溶解曲線的意思以及作用

4樓：匿名使用者

這個用於syber green實時pcr。而使用探針的不需要。

因為syber green是非特異性結合，所以如果有非特異性的序列被擴增，也會同樣產生訊號。在設計引物的時候，可以計算出被擴增序列的tm。pcr反應完成以後，開始進行解離曲線的測量。

一般是對反應產物逐步加溫，每增加一度，測訊號一次。pcr產物會在溫度達到tm時發生解離，熒光訊號會一下子消失、如果把溫度和熒光訊號的變化做一個圖，就會看到一開始，熒光訊號沒有變化，是一個平直的線。達到tm附近是，會有一個比較銳利的峰，說明訊號的變化很大，繼續加熱超過tm，這是雙鏈都開啟了。

所以訊號也不會再有變化，所以又是平直的線。

如果產物都是特異性的，就是我上面說的那樣。如果有非特異性產物，就會出現不在tm就出現峰值，或者有矮而胖的峰值等等異常情況出現，這樣，那個管子的樣本就不能用了。

熒光定量pcr 溶解曲線出現雜峰，不知是引物問題還是什麼

5樓：南京金益柏生物科技****

用來做測試的cdna濃度應該比較高，而正式進行定量的模板濃度應該是有高有低吧，低濃度下出現非特異性溶解峰比較正常