1樓：匿名使用者
熒光定量pcr的溶解曲線理解：用syber green方法做完pcr後，用來判斷產物是否相對專一。應結束後，逐漸加溫。和syber
green分子結合的pcr產物隨溫度升高逐漸變為單鏈，就不能在和syber
green結合。
一般每加溫一度，讀一次訊號。當溫度到達pcr產物的tm時，產物解離一下增多。曲線的橫座標是溫度，而縱座標是熒光訊號的變化，開始加熱，訊號變化不大，所以幾乎是平的。
接近tm時，突然變化加大，所以出現峰值。再升溫，產物全部解離，就又是一條直線了。如果有非特異性產物，在加熱過程中就會出現一些比較矮，寬的峰。
2樓：匿名使用者
這個一般是用syby green作為熒光染料的時候需要做的工作！
因為syby green染料是非特異的染料，只要有擴增，染料就可以鑲嵌在雙鏈中發出熒光。我們做溶解曲線是為了觀察我們擴增發出熒光的片段是不是我們需要的產物。如果溶解曲線做出來只有單峰，且出鋒位置是你的退火溫度，那麼這個是你的產物發出的熒光，實驗結果有效。
如果出現多鋒或退火溫度不對，那麼這個實驗結果是不可信的！你需要再次調整！
誰能具體解釋一下熒光定量pcr中溶解曲線的意思以及作用
3樓：匿名使用者
溶解曲線是判斷擴增產物是否單一的曲線，顧名思義，其跟模板（或其濃度）沒有關係，擴增什麼基因就應該有其相對應的溶解曲線，類似於電泳。那麼你擴增幾種基因就應該有幾種對應的峰（一般sybr法的目的基因在80~90℃之間），我說的是一般情況，這個跟擴增片段長短有關係。出現其他峰就該考慮是否為引物二聚體（一般為60~75℃之間）視引物長度而定，而基因組dna汙染的峰會在90℃以後。
出現引物二聚體可能是引物設計、引物加量等原因（也有可能是從加完反應液到上機開始pcr這之間的時間過長）所致；基因組dna那麼考慮設計跨內含子引物或者實驗之前做gdna的消除工作。而陰性對照有目的峰那可能就是模板汙染，注意實驗操作等避免模板汙染。
詳細請見我的回答
4樓：表詠蒿樂蓉
用syber
green方法做完pcr後，用來判斷產物是否相對專一。反應結束後，逐漸加溫。和syber
green分子結合的pcr產物隨溫度升高逐漸變為單鏈，就不能在和syber
green結合。一般每加溫一度，讀一次訊號。當溫度到達pcr產物的tm時，產物解離一下增多。
曲線的橫座標是溫度，而縱座標是熒光訊號的變化！開始加熱，訊號變化不大，所以幾乎是平的，接近tm時，突然變化加大，所以出現峰值。再升溫，產物全部解離，就又是一條直線了。
如果有非特異性產物，在加熱過程中就會出現一些比較矮，寬的峰。
誰能具體解釋一下熒光定量pcr中溶解曲線的意思以及作用
5樓：匿名使用者
這個用於syber green實時pcr。而使用探針的不需要。
因為syber green是非特異性結合，所以如果有非特異性的序列被擴增，也會同樣產生訊號。在設計引物的時候，可以計算出被擴增序列的tm。pcr反應完成以後，開始進行解離曲線的測量。
一般是對反應產物逐步加溫，每增加一度，測訊號一次。pcr產物會在溫度達到tm時發生解離，熒光訊號會一下子消失、如果把溫度和熒光訊號的變化做一個圖，就會看到一開始，熒光訊號沒有變化，是一個平直的線。達到tm附近是，會有一個比較銳利的峰，說明訊號的變化很大，繼續加熱超過tm，這是雙鏈都開啟了。
所以訊號也不會再有變化，所以又是平直的線。
如果產物都是特異性的，就是我上面說的那樣。如果有非特異性產物，就會出現不在tm就出現峰值，或者有矮而胖的峰值等等異常情況出現，這樣，那個管子的樣本就不能用了。
熒光定量pcr熔解曲線
6樓：匿名使用者
溶解曲線是在正常的pcr反應基礎上加一個溶解曲線的反應條件，其中當溫度由60℃升至95℃時，pcr儀每隔一定的溫度檢測一次訊號。最後將收集的訊號繪製出溶解曲線，然後將溶解曲線一次微分就會得到我們平時看到的峰性圖。每一條線代表著某個孔裡的反應體系裡產物的單一情況，某一條線如果為單峰且在一定合理的溫度範圍內（一般為80~90℃）則認為正常，如果為雙峰則可能有非特異性擴增。
由此可以判斷產物是否為目的基因且是否單一。內參有內參的線，目的基因有目的基因的線，同一條線不會出現兩個基因的峰。你可以看一下溶解曲線的橫、縱座標。
7樓：烏冬蛋白
內參量多，迴圈數少吧，我也不熟
熒光定量pcr中溶解曲線的溫度大概是多少
8樓：祝您每天開心
一般染料法定量pcr在進行完pcr後都要執行熔解曲線,一般設定先94度幾分鐘,然後驟冷到65度（假定65度為退夥溫度）.在65度時,pcr產物是以雙鏈的形式存在的。
因為染料是插到雙鏈dna的小溝裡然後發熒光的,所以這個時候檢測到很強的光訊號,隨著溫度升高,雙鏈逐漸開啟,熒光訊號逐漸減弱。
9樓：匿名使用者
realtime pcr的溶解曲線的出峰溫度一般在85度——90度，溶解溫度是指核酸片段解鏈一半時的溫度。哪些因素影響熔解溫度呢？pcr產物大小，gc含量等，一般的熔解溫度是要大於80度的。
我們實驗室用bioghc -pcr檢測了dna,溶解曲線是為了驗證擴增產物特異性的
熒光定量pcr溶解曲線問題
10樓：匿名使用者
通過你的描述目前還有很多資訊不實很瞭解：目的片段長度？pcr反應條件？
管家基因的溶解曲線怎麼樣？做的什麼實驗？是否將產物跑了電泳，條帶怎麼樣？
你可以將上述問題整理一下在一些專業性較強的生物論壇發帖子讓其他大神幫你分析一下。比如丁香園、生物秀等等。
出現怪異的溶解曲線大部分都是機器設定或者反應體系的問題，建議：
1、將擴增產物跑一下電泳，看一下目的條帶亮不亮2、一般定量pcr擴增後目的片段的峰在80~90℃之間，反應條件確認一下設定是否有問題
3、適當增加模板量或者減少引物濃度。
4、用的是哪個公司的酶？問一下這個公司的技術支援
熒光定量pcr結果溶解曲線有雙峰，結果可用嗎
11樓：匿名使用者
根據曲線初步判斷，整個實驗設計還可以！你做相對定量嗎，將樣品結果與對照看看基因表達量分析就可以了！ 如果絕對定量，需要進一步實驗吧！
請問：實時熒光定量pcr怎樣設定才能有溶解曲線？
12樓：匿名使用者
有一種可能是，在試驗開始的設定階段，需要為整個實驗設計出熔解曲線的程式，這個您可能忘記了。
13樓：匿名使用者
在設定反應程式時，在最後加一步
實時熒光定量pcr，溶解曲線怎麼判斷是否為目的產物
14樓：南京金益柏生物科技****
根據曲線初步判斷，整個實驗設計還可以！你做相對定量嗎，將樣品結果與對照看看基因表達量分析就可以了！ 如果絕對定量，需要進一步實驗吧！
15樓：為青生物
溶解曲線的單峰明顯，橫座標在80度以上，一般就是pcr產物
您好，我想問一下熒光定量PCR產物的溶解曲線中Tm值在92度
這個是可以的。根據擴增產物gc含量的不同，tm有可能很高。只要解離曲線有一個很銳的峰，就沒有問題。我以前為了提高特異性，專門設計過高tm值的引物。您好，我想問一下熒光定量pcr產物的溶解曲線的tm值在92度可以嗎？是不是在86 88度之間最好？謝謝 這個不是絕對的，只是大多數rt pcr產物的tm值...
誰能具體解釋一下熒光定量PCR中溶解曲線的意思以及作用
這個用於syber green實時pcr。而使用探針的不需要。因為syber green是非特異性結合，所以如果有非特異性的序列被擴增，也會同樣產生訊號。在設計引物的時候，可以計算出被擴增序列的tm。pcr反應完成以後，開始進行解離曲線的測量。一般是對反應產物逐步加溫，每增加一度，測訊號一次。pcr...
求助關於熒光定量PCR的CT值問題
怎麼了,熒光訊號值達到設定閾值所需的迴圈數就是ct值 求助關於熒光定量pcr的ct值問題 如果有標準曲線,按照標準曲線計算。一般都是相對量。則用delta delta ct方法來計算。舉例如下 對照組基因a的ct值為20,內參 比如 actin ct值15。實驗組基因a ct值18,內參ct值14。...