1樓:龍鳳油洺月
怎麼了,熒光訊號值達到設定閾值所需的迴圈數就是ct值
求助關於熒光定量pcr的ct值問題
2樓:林顧姝
如果有標準曲線,按照標準曲線計算。
一般都是相對量。則用delta delta ct方法來計算。舉例如下:
對照組基因a的ct值為20, 內參(比如βactin)ct值15。實驗組基因a ct值18,內參ct值14。
首先算加樣量:delta ct=15-14=1。2的1次方是2。也就是說實驗組的加樣量是對照組的2倍。
基因a: delta ct=20-18=2。2的2次方是4。也就是說基因a的量在實驗組是對照組的4倍。但是由於加樣量是2倍,所以4處以2=2,最後的相對量是2倍。
幾點注意:
1。必須確定擴增的特異性
2。 只有相同目標的ct值才能相減(擴增效率有可能不同)
3。 2的某次方只是理論值,實際擴增效率低於2。
4。 最好不用syber green
3樓:琦桂花富羅
看了你空間裡的溶解曲線,你可以看到溶解峰的溫度都很低,全在80以下,你擴出來的東西多半隻是引物,你跑定量的時候有做ntc的孔嗎,如果有做,可以對照ntc組和加了模板的組,溶解峰還是一樣的話,那你擴出來的產物100%是引物了。
再有,你的擴增曲線問題,ct太了,一般做定量認為ct=25時,是一個模板擴出來的,所以當大於25擴出來的結果都不可信。
還有,你反轉錄的時候rna加多少,2微克?,反轉錄體系是多少,20微升?反轉錄之後按照多少比例稀釋,1比4?
總之,問題可以再問詳細一點,也可以直接hi我
如果做過ntc那溶解峰就沒問題了,而且都很單一,特異性蠻好的。沒稀釋的cdna做的定量,ct大於30?你p的什麼基因呢,表達量也太低了吧,內參的ct呢,也是這麼低嗎
熒光定量pcr的結果(ct值)怎麼分析
4樓:匿名使用者
目的基因熒光達到閾值時的迴圈數~ct值越低代表起始模板數量越大~
求助熒光定量pcr,我的實驗組和對照組的目的基因ct值非常相近,但是兩組內參基因的ct值相差5左右,正常嗎
5樓:匿名使用者
肯定不行的。熒光定量pcr通過以內參基因作為標準進行相對定量,即眾所e68a8462616964757a686964616f31333330363736周知的2–δδct 法,(前提是要求在所有測試樣本中恆定表達的已知參照基因,而且表達水平不受研究條件及處理方式的影響)。如果實驗組和對照組的目的基因ct值非常接近(前提是cdna稀釋的倍數一致), 說明二者的目的基因無明顯變化呀。
4.2.3.1 2–δδct (livak) 方法
進行相對基因表達分析普遍採用操作簡便的2–δδct 法,條件是目標基因和參照基
因擴增效率都接近100% 且相互間效率偏差在5% 以內。使用2–δδct 法之前,必須驗
證目標基因和參照基因的擴增效率。
一旦確定目標基因和參照基因有相似且接近100% 的擴增效率,你就可以確定不
同樣本中目標基因表達水平的相對差異,步驟如下:
首先,對所有的測試樣和校準樣本,用內參基因的ct 值歸一目標基因的ct 值:
δct(test) = ct(target, test) – ct(ref, test)
δct(calibrator) = ct(target, calibrator) – ct(ref, calibrator)
其次,用校準樣本的δct 值歸一試驗樣本的δct 值:
δδct = δct(test) – δct(calibrator)
最後,計算表達水平比率:
2–δδct = 表達量的比值
得到的結果是通過參照基因表達水平校準的試驗樣本中目標基因相對於校準樣本
的增加或減少的倍數,用參照基因校準目標基因表達的目的是彌補樣本組織量的差異。
如果目標和內參基因的擴增效率不相近,可以優化或重新設計實驗,或者可以
採用4.2.3.3 節中闡述的pfaffl 法。另外,如果目標基因和參照基因有同樣的擴增效
率,但是擴增效率不等於2,那麼,2–δδct 法的公式可以修正為用實際擴增效率值代
替等式中的2。例如,如果目標基因和參照基因的擴增效率都為1.95,計算公式為
1.95–δδct。
下邊的假定的例子告訴你如何使用2-δδct 法來決定一個目標基因(p53)在腫瘤
和正常卵巢組織的表達的相對水平。
例子:正常和腫瘤組織50ngrna 得到的cdna 用來分析p53(目標基因)和
gapdh(參照基因)。gapdh 用來作為參照是因為以前的研究表明這個基因在正常
和腫瘤組織中沒有差異。
樣品ct p53 (目標基因) ct gapdh (參照基因)
正常(校準樣本) 15.0 16.5
腫瘤(試驗樣本) 12.0 15.9
為了用上面介紹的方法進行相對定量分析,在檢測和校準的樣品中靶基因的ct
值和內參的ct 值進行歸一化:
δct(正常) = 15.0 – 16.5 = –1.5
δct(腫瘤)= 12.0 – 15.9 = –3.9
然後,試驗樣本的與校準樣本的δct 值進行歸一化
δδct = δct(腫瘤)– δct(正常)
= –3.9 – (–1.5) = –2.4
最後,計算表達比率:
2–δδct = 2–(–2.4) = 5.3
因此,腫瘤細胞的p53 表達水平比正常細胞高5.3 倍
希望能幫上你。
6樓:匿名使用者
你的實驗組和度招租的模板濃度不一樣吧,那樣內參基因的ct值肯定是不一樣的!
7樓:匿名使用者
正常的,因為你提取兩個材料的rna的量不同。你根據資料算下表達量具體是差幾倍,看是否與你的預期相符
熒光定量pcr中關於閾值的設定是否會影響ct值?
8樓:匿名使用者
閾值和基線的設定肯定會影響ct值,你可以採用每次反應完後軟體自己選定的閾值。你也可以手動調整,但是如果你是相同的模板,做不同反應,那你必須使兩次實驗的閾值和基線調到相同。使用相同的標準品,才能減小不同批次反應的誤差。
9樓:
閾值和基線的設定是會影響ct值的,一般儀器會自動對基線和閾值進行優化,一般選用儀器上的設定就可以了。
但有些時候也需要調整,主要根據標準曲線上的斜率,擴增效率和r2值進行調整,將斜率調到合適的位置即可。
當然也可以在每次進行實驗時設定1-2個內參,根據內參調整引數。
請問我在做熒光定量pcr的時候內參的ct值很低大約在35左右,而目的基因ct值在25左右 有哪位高手能指點一下
10樓:匿名使用者
你選了個什麼內參,表達量如此之低?感覺有點問題,檢查一下融解曲線對不對。
如果是正確的,說明你的目的基因表達量比內參高出一千倍啊。
ct值越大,表達量越低。
11樓:糟油酒丸
看看你的gapdh引物tm多少,有可能是因為pcr條件適合目的基因引物對而不適合內參引物對嗎?
求助關於熒光定量PCR的CT值問題
如果有標準曲線，按照標準曲線計算。一般都是相對量。則用delta delta ct方法來計算。舉例如下 對照組基因a的ct值為20，內參 比如 actin ct值15。實驗組基因a ct值18，內參ct值14。首先算加樣量 delta ct 15 14 1。2的1次方是2。也就是說實驗組的加樣量是對...
實時熒光定量pcr因子表達量越少ct值越小嗎
看了你空間裡的溶解曲線，你可以看到溶解峰的溫度都很低，全在80以下，你擴出來的東西多半隻是引物，你跑定量的時候有做ntc的孔嗎，如果有做，可以對照ntc組和加了模板的組，溶解峰還是一樣的話，那你擴出來的產物100 是引物了。再有，你的擴增曲線問題，ct太了，一般做定量認為ct 25時，是一個模板擴出...
怎麼理解熒光定量pcr的溶解曲線
熒光定量pcr的溶解曲線理解 用syber green方法做完pcr後，用來判斷產物是否相對專一。應結束後，逐漸加溫。和syber green分子結合的pcr產物隨溫度升高逐漸變為單鏈，就不能在和syber green結合。一般每加溫一度，讀一次訊號。當溫度到達pcr產物的tm時，產物解離一下增多。...