1樓：墨汁諾
pcr的反應條件與很多引數有關係。如模板濃度，引物長度及gc含量，引物濃度，dntps濃度，選用的taq enzyme,緩衝液的離子含量，產物大小，變性時間，退火溫度及時間，延長的時間。
物理原因：變性對pcr擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低pcr擴增效率。
有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是pcr失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其pcr擴增是不會成功的。
2樓：逆長小白菜
pcr反應的關鍵環節有①模板核酸的製備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④pcr迴圈條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消 化除淨，特別是染色體中的組蛋白，④在提取製備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。
在酶和引物***時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配製有效而穩定的消化處理液，其程式亦應 固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加taq酶或溴乙錠。
引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是pcr失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：
①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看od值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做pcr有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。
③引物應高濃度小量分裝儲存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
mg2+濃度：mg2+離子濃度對pcr擴增效率影響很大，濃度過高可降低pcr擴增的特 異性，濃度過低則影響pcr擴增產量甚至使pcr擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變：通常進行pcr擴增採用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多 大體積進行pcr擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 後，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對pcr擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低pcr擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是pcr失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其pcr擴增是不會成功的。
3樓：
ssr用4%page膠檢測,加樣時一定要注意最後分開加的引物家進去了,而且夠量(0.5ul是很少的,要注意).我用的pcr程式是94度10分鐘,94度35秒.
55度35秒,72度45秒,35迴圈,最後再10分鐘的72度.
你測到的1.8只是說明dna比較純,也許模板濃度不夠啊,要達到5ng/ul以上才好用,模板濃度太低也擴不出來的.
你跑膠之後有沒有引物二聚體的帶,如果有,說明模板加的正常,如果沒有,可能是加模板沒加好.
水只要用滅菌的純水就行了,沒什麼的,師兄都說pcr是很粗放,很簡單的.加油!!!
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