1樓：北京索萊寶科技****
溴化乙錠通過嵌入鹼基之間而與dna結合，進而使雙螺旋解旋。由此導致線狀dna的長度有所增加，作為補償，將在閉環質粒dna中引入超螺旋單位。最後，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分子的繼續嵌入。
但線狀分子不受此限，可繼續結合更多溴化乙錠，直至達到飽和( 每2個鹼基對大約結合1個溴化乙錠分子) 。由於染料的結合量有所差別，線狀和閉環dna分子在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為製備大量質粒dna 的首選方法。
然而該過程既昂貴又費時，為此發展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉澱等分離質粒dna和宿主dna的方法。儘管這些方法大多數均被束之高閣，但其中最好的方法，也應是聚乙二醇分級沉澱法。
從大腸桿菌細胞中分離質粒dna的方法眾多，其分離的依據可利用分子大小不同，鹼基組成的差異以及質粒dna的超螺旋共價閉合環狀結構的特點來進行。鹼基性法抽提效果良好，既經濟且得率較高。抽提到的質量dna可用於酶切、連線和轉化。
對於分子量較大拷貝較少對的質粒dna，由於dn**段較大易於損傷斷裂，因此選用呂華銫密度超高離心法抽提dna，且具有純度高、步驟少、方法穩定且獲得的質量dna是超螺旋構型等特點。對於高拷貝數質粒，用少量製備法抽提質粒dna就有足夠量可用於基因操作。
質粒dna純化的試驗步驟：
測量dna溶液的體積，按lg/ml的用量精確地加入固體cscl, 將溶液加溫至30℃助溶。溫和地混勻溶液直到鹽溶解。
每10mldna溶液加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶於水）；立即將溴化乙錠溶液（漂浮在表層）與dna－氯化銫溶液混勻， 溶液的終密度應為1.55g/ml（溶液的折射率為1.
3860）溴化乙錠濃度大約740μg/ml。【溴化乙錠貯存液應貯存於避光容器內（如用錫箔完全包裹的瓶子），於室溫儲存。
室溫下用sorvall ss34頭（或與其相當的轉頭）以8000rpm離心5min， 浮在溶液上面的水垢狀浮渣是溴化乙錠和細菌蛋白所形成的複合物。
用巴斯德吸管或帶大號針頭的一次性注射器將浮渣下的清亮紅色溶液轉移到離心管中。用輕石蠟油加滿管的其餘部分並封口。
以20℃對所得的密度梯度以45 000rpm離心16h（vti65 轉頭）、 以45 000rpm離心48h（ti50轉頭）、以60 000rpm離心24h（ti65轉頭）或者以60 000rpm離心24h（ti70.1轉頭）。普通光照下，在梯中心可見兩條dna區帶， 上部區帶材料通常較少，由線狀的細菌（染色體）dna和帶切口的環狀質粒dna組成：
下部區帶則由閉環質粒dna組成。管底部深紅色的沉澱是溴化乙錠rna複合物，位於cscl溶液和石蠟油之間的是蛋白質。beckman quick-seal離心管中的cscl－溴化乙錠梯度可容納4mg 閉環質粒dna而不至超負荷。
如有更大量的質粒存在，將擴充套件為一條寬頻，並與染色體dna相重疊。這種問題只有在質粒複製達到極高水平時才會出現，只要將該質粒提取物分為2個梯度即可解決。如出現負荷，可收集整個dna區高產水平時才會出現，只要將該質粒提取物分為2個梯度即可解決。
如出現超負荷，可收集整個dna區帶，用cscl溶液（ρ=1.58g/ml）將體積調到15ml，在兩個離心管中再度離心，使dna達到平衡。
收集dna帶。將21 號皮下注射針頭插入管的頂端以使空氣進入，為儘量減少汙染的機會，首先用18號皮下注射針頭按下述方法收集上部的區帶（雜色體dna）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然後將一塊soctch膠帶貼於管外壁。
穿過soctch膠帶將18號皮下注身針頭（其斜面向上）插入管中，以便使針頭的斜面開口恰好位於染色體dna區帶之下並與該區帶相平行。將粘稠狀dna收集到一次性使用的管內，用造型粘土塊封住皮下注射針頭的末端並將第2根針頭留於原處。 穿過soctch 膠帶插入第3根皮下注射針頭（18號），將下部的質粒dna區帶收集到玻璃或塑料管中。
質粒dna的大量提取和純化有哪些步驟
2樓：架構工程師
大提質復粒和小提質粒的基制
本原理是一樣的，都是通bai
過一定的方法（如du加鹼裂解）使在細菌zhi內大量擴增的質粒釋放dao出來，然後經過去蛋白去rna等一系列步驟純化dna，最終將dna提取出來。區別：
1.大提用於大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，而小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。
2.一般試劑盒中大提比小提多了溶菌酶、異丙醇（**沉澱核酸）、含一定量peg的氯化物（**質粒dna）及乙酸銨等，其作用及目的都是有利於細菌的裂解和質粒的純化，所以大提的產物比小提的量多很多，而且純度很高。
3.小提一般用於質粒鑑定和對純度要求不是很高的實驗，大提用於質粒的大量提取和轉染等純度要求很高的實驗。
如果提取的質粒DNA汙染有少量染色體DNA,你們在操作過程中哪既不最可能出現問題
加入裂解液的時來候顛倒混勻的動自 作幅度bai太大，會導du致基因組dna斷裂成小片段，和zhi質粒混dao在一起。沉澱以後，吸取上清液的時候不小心吸入沉澱，會把夾在沉澱中的基因組dna也一起吸入矽膠吸附柱，這一步的可能性更大，通常都是這一步混入的基因組dna。把問題寫明白了再問效果最最佳。看到你的...
質粒的問題
基因載體的條bai件 一 du能自主複製或隨受zhi體細胞染色體dna一起復制dao。二 易於鑑定和篩選專。三 限屬制酶對其作用的切割點少。四 易與引入受體細胞。質粒 是細菌染色體外的小型環狀雙鏈dna,質粒可以自我複製,而且質粒上有多個限制性內切酶的酶切位點,而且質粒上帶有選擇性標記位點,而且質粒...
關於重組質粒轉化的問題,關於重組質粒轉化的問題
好像是bai這麼回事 我當時du沒有認真聽zhi講 冷凍和cacl2使得dao 細胞膜變得脆 流動內性差 這時進行熱容擊過程容易使其出現孔洞,使得dna可以進到細胞裡。溫度是比較高的,時間長的話細胞容易死掉。我們當時做的是120秒 溫度低則效果不好。後一問不清楚。可能是特定的熱穩定dna聚合酶作用的...