1樓：北京索萊寶科技****
正常來情況下是不需要的,溶解曲線是在源sybr green法中利用染料在dna解鏈時釋放不發射熒光,而在dna雙鏈時與其結合發射熒光的原理製作溶解曲線的,而taqman探針在pcr反應時其寡核苷酸鏈由於被dna聚合酶的外切酶活性給切斷,所以不能重新再結合故不能形成探針,所以不需要做溶解曲線.再一個,溶解曲線只是為反應體系中判斷是否有非特異性擴增提供一個側面的依據,適用於染料法.而探針法的特異性很高,從這方面來看也是不需要的.
怎麼理解熒光定量pcr的溶解曲線
2樓：匿名使用者
熒光定量pcr的溶解曲線理解：用syber green方法做完pcr後，用來判斷產物是否相對專一。應結束後，逐漸加溫。和syber
green分子結合的pcr產物隨溫度升高逐漸變為單鏈，就不能在和syber
green結合。
一般每加溫一度，讀一次訊號。當溫度到達pcr產物的tm時，產物解離一下增多。曲線的橫座標是溫度，而縱座標是熒光訊號的變化，開始加熱，訊號變化不大，所以幾乎是平的。
接近tm時，突然變化加大，所以出現峰值。再升溫，產物全部解離，就又是一條直線了。如果有非特異性產物，在加熱過程中就會出現一些比較矮，寬的峰。
3樓：匿名使用者
這個一般是用syby green作為熒光染料的時候需要做的工作！
因為syby green染料是非特異的染料，只要有擴增，染料就可以鑲嵌在雙鏈中發出熒光。我們做溶解曲線是為了觀察我們擴增發出熒光的片段是不是我們需要的產物。如果溶解曲線做出來只有單峰，且出鋒位置是你的退火溫度，那麼這個是你的產物發出的熒光，實驗結果有效。
如果出現多鋒或退火溫度不對，那麼這個實驗結果是不可信的！你需要再次調整！
如何作qpcr的標準曲線
4樓：夏娃的夏天
作qpcr的標準曲線可以用pcr－elisa法作。
具體如下：
pcr－elisa法：
利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合；
再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。
常規的pcr－elisa法只是定性實驗，加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。
通過測定一系列已知組分的標準物質的某理化性質，從而得到該性質的數值所組成的曲線。
擴充套件資料：
實時熒光定量pcr技術，在pcr反應體系中加入熒光基團，利用熒光訊號積累實時監測整個pcr程序，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
檢測方法：
1、sybrgreenⅰ法：
在pcr反應體系中，加入過量sybr熒光染料，sybr熒光染料特異性地摻入dna雙鏈後，發射熒光訊號。
而不摻入鏈中的sybr染料分子不會發射任何熒光訊號，從而保證熒光訊號的增加與pcr產物的增加完全同步。
sybr定量pcr擴增熒光曲線圖、pcr產物熔解曲線圖（單一峰圖表明pcr擴增產物的單一性）。
2、taqman探針法：
探針完整時，報告基團發射的熒光訊號被淬滅基團吸收；
pcr擴增時，taq酶的5』-3』外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光訊號。
即每擴增一條dna鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光訊號的累積與pcr產物的形成完全同步。
pcr反應的前15個迴圈的熒光訊號作為熒光本底訊號，熒光閾值的預設（預設）設定是3-15個迴圈的熒光訊號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10*sdcycle 3-15。
利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫座標代表起始拷貝數的對數，縱座標代ct值。因此，只要獲得未知樣品的ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
誰能具體解釋一下熒光定量pcr中溶解曲線的意思以及作用
5樓：匿名使用者
溶解曲線是判斷擴增產物是否單一的曲線，顧名思義，其跟模板（或其濃度）沒有關係，擴增什麼基因就應該有其相對應的溶解曲線，類似於電泳。那麼你擴增幾種基因就應該有幾種對應的峰（一般sybr法的目的基因在80~90℃之間），我說的是一般情況，這個跟擴增片段長短有關係。出現其他峰就該考慮是否為引物二聚體（一般為60~75℃之間）視引物長度而定，而基因組dna汙染的峰會在90℃以後。
出現引物二聚體可能是引物設計、引物加量等原因（也有可能是從加完反應液到上機開始pcr這之間的時間過長）所致；基因組dna那麼考慮設計跨內含子引物或者實驗之前做gdna的消除工作。而陰性對照有目的峰那可能就是模板汙染，注意實驗操作等避免模板汙染。
詳細請見我的回答
6樓：表詠蒿樂蓉
用syber
green方法做完pcr後，用來判斷產物是否相對專一。反應結束後，逐漸加溫。和syber
green分子結合的pcr產物隨溫度升高逐漸變為單鏈，就不能在和syber
green結合。一般每加溫一度，讀一次訊號。當溫度到達pcr產物的tm時，產物解離一下增多。
曲線的橫座標是溫度，而縱座標是熒光訊號的變化！開始加熱，訊號變化不大，所以幾乎是平的，接近tm時，突然變化加大，所以出現峰值。再升溫，產物全部解離，就又是一條直線了。
如果有非特異性產物，在加熱過程中就會出現一些比較矮，寬的峰。
定量pcr法中taqman探針法需要做溶解曲線嗎？為什麼
正常情況下是不需要的,溶解曲線是在sybr green法中利用染料在dna解鏈時釋放專不發射熒光,而在dna雙鏈屬時與其結合發射熒光的原理製作溶解曲線的,而taqman探針在pcr反應時其寡核苷酸鏈由於被dna聚合酶的外切酶活性給切斷,所以不能重新再結合故不能形成探針,所以不需要做溶解曲線.再一個,...
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