1樓：匿名使用者
1.sybrgreenⅰ法：
在pcr反應體系中，加入過量sybr熒光染料，sybr熒光染料特異性地摻入dna雙鏈後，發射熒光訊號，而不摻入鏈中的sybr染料分子不會發射任何熒光訊號，從而保證熒光訊號的增加與pcr產物的增加完全同步。
sybr定量pcr擴增熒光曲線圖
pcr產物熔解曲線圖（單一峰圖表明pcr擴增產物的單一性）2.taqman探針法：
探針完整時，報告基團發射的熒光訊號被淬滅基團吸收；pcr擴增時，taq酶的5』-3』外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光訊號，即每擴增一條dna鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光訊號的累積與pcr產物的形成完全同步。
實時熒光定量pcr的結果該怎樣分析？
2樓：群英鬥將
1、如果有標準曲線，按照標準曲線計算；
2、一般都是相對量，則用delta delta ct方法來計算；
3、引物或探針降解：可通過page電泳檢測其完整性；
4、模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起；
5、看ct值是分析熒光定量pcr最直觀的一個資料，ct值一般在35左右就失去參考價值了，平時我們實驗室用biodai-pcr熒光定量法測得的擴增曲線的起跳值基本在30左右。
擴充套件資料：
pvr的迴圈引數：
1、預變性；
模板dna完全變性與pcr酶的完全啟用對pcr能否成功至關重要，加熱時間參考試劑說明書。
2、變性步驟；
迴圈中一般95℃，30秒足以使各種靶dna序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。
3、引物退火；
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的tm值為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對pcr的特異性有較大影響。
4、引物延伸；
引物延伸一般在72℃進行（taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。
5、迴圈數；
大多數pcr含25-35迴圈，過多易產生非特異擴增。
6、最後延伸；
在最後一個迴圈後，反應在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸完全，並使單鏈產物退火成雙鏈。
3樓：南京金益柏生物科技****
用2-△△ ct法算的話，應如何算？ 假設檢測a基因，ct分別為（這裡記住ct越大，表明相對含量越低） 普通組/test1：28 實驗組1/test2：
29 實驗組2/test3：30 這時候要設對照了，假設test1為對照組（普通組），當然是以普通組為對照 那麼，相對含量為。
4樓：匿名使用者
看ct值、起始拷貝數、標準偏差等
如果是sybr做的話，再看下溶解曲線
實時熒光定量pcr內參是什麼東西
5樓：禾鳥
1、實時熒光定量pcr內參：
在不同的pcr反應管中已定量的內參和引物，內參用基因工程方法合成。上游引物用熒游標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內參也被擴增。
在pcr產物中，由於內參與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內參為對照定量待檢測模板。
2、選擇：內參一般是固定的，可以用實驗室之前就有的。或者用基因工程方法合成。上游引物用熒游標記，下游引物不標記。
擴充套件資料
（1）內參在傳統定量中的作用：
由於傳統定量方法都是終點檢測，即pcr到達平臺期後進行檢測，而pcr經過對數期擴增到達平臺期時，檢測重現性極差。同一個模板在96孔pcr儀上做96次重複實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。
加入內參後，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
（2）內參對定量pcr的影響：
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則pcr反應變為雙重pcr，雙重pcr反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著。
但由於待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內參。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內參，但仍然只是一種半定量的方法。
6樓：小笑聊情感
實時熒光定量pcr內參是一種在dna擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（pcr）迴圈後產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定dna序列進行定量分析的方法。
7樓：匿名使用者
內參就是一個表達量在各個組基本保持不變的基因，又叫看家基因，比如常用的gapdh， actin。或者18s rrna也可以。
如果內參表達量一致，說明你pcr的上樣量一致，樣本的質量也一致。如果出入很大，說明你的樣本的濃度或者是質量有問題。測到的目的基因的表達量就不可靠了
8樓：匿名使用者
管家基因，具體可以諮詢公司，也可以自己看文獻，常用的有gapdh，beta-actin和18srna，根據不同的**選用不同的管家基因，比如gapdh就被人詬病做癌細胞基因時超不準。。。
9樓：xueling黃
如果對內參要求很高的話，可以篩選合適內參，有免費的軟體，比如genorm，normfinder等
實時熒光定量pcr與基本pcr相比有什麼優點
10樓：杏雀烈
熒光定量pcr與普通pcr相比具有以下優點：
1、高靈敏性 可檢測單個細胞基因；
2、高特異
11樓：匿名使用者
普通的pcr大多數是定性實驗，而實時熒光定量pcr則定量和定性都可以做。應用領域也不一樣，普通pcr一般應用於基因組克隆、dna測序、rna反轉錄等，而實時熒光定量pcr一般應用於mrna表達量分析、絕對定量、蛋白表達、snp分析、陰陽性解析等領域。不是定量pcr比pcr好，而是兩者應用與不同的領域，起到了不同的作用。
熒光定量pcr較普通pcr不同的一點就是可以實時檢測pcr擴增產物，從而可進行絕對定量或者相對定量。
12樓：奔馬的香香豬
pcr實驗主要採用sybr green染料法和taqman探針法，biog技術採用經化學修飾的熱啟動聚合酶，有效避免了非特異擴增，具有高度的特異性。反應緩衝液經多次優化，與熱啟動聚合酶具有最為樂觀的搭配，使聚合酶的活效能夠得到最大程度的發揮。反應靈敏快速，40個迴圈只需20多分鐘的時間。
在20ul的反應體系裡，只要有幾個拷貝的dna分子就能被檢測出來。
實時熒光定量pcr與普通pcr的區別是什麼？結果有何異同？能說明的問題是什麼？
13樓：麼破1自我
二者結果相同。都能說明生物體外的特殊dna複製的整個過程的擴增效率和溶解溫度情況。
區別：1、二者系統組成不同
熒光定量pcr儀比普通的pcr儀多了熒光訊號採集系統和計算機分析處理系統。
2、二者原理不同
熒光定量pcr實時監測與dna結合的熒光染料激發的熒光，普通ocr通過檢測插入dna中核算染料的量來測定pcr最終產物量。
3、二者反應要求不同
熒光定量pcr對擴增片段有較高的要求，一般為100-300bp，普通pcr可以擴增長點的片段。
4、二者應用不同
熒光定量pcr主要是用來定量分析和確定基因轉錄水平的，普通的pcr儀是做定性分析和擴增基因片段，定量pcr儀可以做普通pcr儀的工作，反之不行。
5、二者測量成本不同
定量pcr儀**較為昂貴，普通的基因擴增儀(pcr儀)只能夠定性地分析是否存在目標片段。但是**要低很多，而且執行成本也要低很多。
實時熒光定量pcr技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的侷限，實現了每一輪迴圈均檢測一次熒光訊號的強度，並記錄在電腦軟體之中，通過對每個樣品ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。
14樓：匿名使用者
原理不同：熒光定量pcr實時監
測與dna結合的熒光染料激發的熒光；普通pcr通過檢測插入dna中核算染料的量來測定pcr最終產物量，一般是紫外光。
反應要求：熒光定量對擴增片段有較高的要求，一般為100-300bp；普通定量可以擴增長點的片段。如果不需要檢測產物分子量大小，熒光定量可以不進行電泳就對產物進行定量分析，普通pcr必須電泳。
結果：熒光定量可以實現精確定量，普通pcr則不行。熒光定量體現可以看到整個擴增過程，可以看到擴增效率，溶解溫度，直接得到的標準曲線等，這些是普通pcr無法實現的。
如果還不清楚建議去丁香園等**逛逛，希望可以幫到你
15樓：匿名使用者
所謂實時熒光定量pcr技術，是指在pcr反應體系中加入熒光基團，利用熒光訊號積累實時監測整個pcr程序，最後通過標準曲線對未知模板進行「定量分析」的方法。
記住，實時熒光定量是定量分析
16樓：匿名使用者
熒光pcr是為了測量mrna表達量的 普通pcr是為了擴增目的片段的
17樓：匿名使用者
熒光定量是定量的，普通pcr是定性的，結果一個是說明含有多少，另一個說明有還是沒有，前者更精確一點
實時熒光定量pcr不需要跑膠嗎
18樓：匿名使用者
不需要，不需要用瓊脂糖凝膠驗證。因為實時定量pcr那個儀器可以檢測熒光強弱，比膠要靈敏。假如用膠檢測mrna表達量，就不用熒光燃料，直接普通pcr就可以
實時定量pcr的結果是怎樣分析的
19樓：小乾乾
1、如果有標準曲線，按照標準曲線計算。
2、一般都是相對量，則用delta delta ct方法來計算。
3、舉例如下：對照組基因a的ct值為20， 內參（比如βactin)ct值15。實驗組基因a ct值18，內參ct值14。
4、首先算加樣量：delta ct=15-14=1。2的1次方是2。
也就是說實驗組的加樣量是對照組的2倍。基因a: delta ct=20-18=2。
2的2次方是4。也就是說基因a的量在實驗組是對照組的4倍。但是由於加樣量是2倍，所以4處以2=2，最後的相對量是2倍。
5、幾點注意：必須確定擴增的特異性，只有相同目標的ct值才能相減（擴增效率有可能不同），2的某次方只是理論值，實際擴增效率低於2，最好不用syber green。
20樓：豆村長de草
實時熒光定量pcr技術是在pcr反應體系中加入熒光基團，利用熒光訊號積累實時監測整個pcr程序，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
基線在pcr擴增反應的最初數個迴圈裡，熒光訊號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即基線。光域值threshold的設定，一般將pcr反應前15個迴圈的熒光訊號作為熒光本底訊號，熒光域值是pcr3-15個迴圈熒光訊號標準差的10倍，熒光域值設定在pcr擴增的指數期。
融解曲線是用來驗證擴增產物特異性的，如果產物是單一條帶，融解曲線就會出現一尖峰；如果有引物二聚體或其它非特異性擴增，就會出現至少兩個尖峰。
擴充套件資料：
時熒光定量pcr儀real-time qpcr 常見問題分析：
1、無ct值出現
1）檢測熒光訊號的步驟有誤：一般sg法採用72℃延伸時採集，taqman法。則一般在退火結束時或延伸結束採集訊號；
2）引物或探針降解：可通過page電泳檢測其完整性；
3）模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起；
4）模板降解：避免樣品製備中雜質的引入及反覆凍融的情況。
2、ct 值出現過晚（ct>38）
1）擴增效率低:反應條件不夠優化，設計更好的引物或探針、改用三步法 進行反應、適當降低退火溫度、增加鎂離子濃度等；
2）pcr各種反應成分的降解或加樣量不足，
3）pcr產物太長：一般採用80-150bp的產物長度。
3、標準曲線線性關係不佳
1）加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度；
2）標準品出現降解：應避免標準品反覆凍融，或重新制備並稀釋標準品；
3）引物或探針不佳：重新設計更好的引物和探針；
4）模板中存在抑制物，或模板濃度過高。
乙肝病毒HBV DNA實時熒光定量PCR檢測結果是1 79E
不知道你是不是首次發現肝功能不正常。如果是建議你觀察兩三個月再說。每個月檢查一次肝功能，如果穀草轉氨酶 谷丙轉氨酶持續升高超過80，那麼就可以進行抗病毒 了。抗病毒 你要做好長期抗戰的準備。dna6次方屬於中等偏上，很正常的情況，無需給自己太大壓力。找個三甲醫院看病，以免被騙。這份結果是黃疸型肝炎與...
為什麼實時熒光定量pcr做不出來,普通pcr可以
為什麼實時熒光定量pcr做不出來,普通pcr可以普通的pcr大多數是定性實驗回 而實時熒光定量pcr則定量和答定性都可以做。應用領域也不一樣,普通pcr一般應用於基因組克隆 dna測序 rna反轉錄等,而實時熒光定量pcr一般應用於mrna表達量分析 絕對定量 蛋白表達 snp分析 陰陽性解析等領域...
實時熒光定量pcr因子表達量越少ct值越小嗎
看了你空間裡的溶解曲線，你可以看到溶解峰的溫度都很低，全在80以下，你擴出來的東西多半隻是引物，你跑定量的時候有做ntc的孔嗎，如果有做，可以對照ntc組和加了模板的組，溶解峰還是一樣的話，那你擴出來的產物100 是引物了。再有，你的擴增曲線問題，ct太了，一般做定量認為ct 25時，是一個模板擴出...