1樓：南京金益柏生物科技****
我們一般把
熒光pcr的前15個迴圈訊號作為熒光本底訊號（baseline，基線期），即樣專
本的熒光背景值和屬陰性對照的熒光值，擴增的熒光訊號被熒光背景訊號所掩蓋。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光訊號指數擴增階段任意位置上，熒光域值的預設設定是3～15個迴圈的熒光訊號的標準偏差的10倍（機器自動設定）。我們在做熒光定量pcr實驗時，經常採用手動設定，手動設定的原則要大於樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要儘量選擇進入指數期的最初階段，真正的訊號是熒光訊號超過域值。
熒光定量pcr的熒光訊號強度和什麼有關係
2樓：南京金益柏生物科技****
常規pcr中，在擴增反應結束之後，我們一般通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析，無法對pcr擴增反應進行實時檢測，也無法對起始模板準確定量，而很多情況下，我們所感興趣的是起始模板量，如轉基因動植物中插入某種外源基因的拷貝數或者病人中某種病毒dna/rna的精確copy數等，如此，熒光定量pcr技術便應運而生。
1、熒光定量pcr概念
所謂定量pcr技術（real-time pcr），是指在pcr反應體系中加入熒光基團，利用熒光訊號累積實時監測整個pcr程序，最後通過特定數學原理對未知模板進行定量分析的方法
2、熒光定量pcr與普通pcr的主要區別
理論上pcr是一個指數增長的過程，但是實際的pcr擴增曲線並不是標準的指數曲線，而是s形曲線。這是因為隨著pcr迴圈的增多，擴增規模迅速增大，taq酶、dntp、引物，甚至dna模板等各種pcr要素逐漸不敷需求，pcr的效率越來越低，產物增長的速度就逐漸減緩。當所有的taq酶都被飽和以後，pcr就進入了平臺期。
由於各種環境因素的複雜相互作用，不同的pcr反應體系進入平臺期的時機和平臺期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是96次pcr重複實驗，各種條件基本一致，所得結果有很大差異（如下圖），所以在實驗過程中我們不能根據最終pcr產物的量直接計算出起始dna拷貝數。
3．2熒光閾值
我們一般把熒光pcr的前15個迴圈訊號作為熒光本底訊號（baseline，基線期），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值，擴增的熒光訊號被熒光背景訊號所掩蓋。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光訊號指數擴增階段任意位置上，熒光域值的預設設定是3～15個迴圈的熒光訊號的標準偏差的10倍（機器自動設定）。我們在做熒光定量pcr實驗時，經常採用手動設定，手動設定的原則要大於樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要儘量選擇進入指數期的最初階段，真正的訊號是熒光訊號超過域值。
fpkm值與熒光定量pcr之間有什麼關係
3樓：匿名使用者
zhi我們一般把熒dao光pcr的前15個迴圈訊號回作為熒光本底訊號（baseline，基線期答
），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值，擴增的熒光訊號被熒光背景訊號所掩蓋。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光訊號指數擴增階段任意位置上，熒光域值的預設設定是3～15個迴圈的熒光訊號的標準偏差的10倍（機器自動設定）。我們在做熒光定量pcr實驗時，經常採用手動設定，手動設定的原則要大於樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要儘量選擇進入指數期的最初階段，真正的訊號是熒光訊號超過域值。
怎麼理解熒光定量pcr的溶解曲線
4樓：匿名使用者
熒光定量pcr的溶解曲線理解：用syber green方法做完pcr後，用來判斷產物是否相對專一。應結束後，逐漸加溫。和syber
green分子結合的pcr產物隨溫度升高逐漸變為單鏈，就不能在和syber
green結合。
一般每加溫一度，讀一次訊號。當溫度到達pcr產物的tm時，產物解離一下增多。曲線的橫座標是溫度，而縱座標是熒光訊號的變化，開始加熱，訊號變化不大，所以幾乎是平的。
接近tm時，突然變化加大，所以出現峰值。再升溫，產物全部解離，就又是一條直線了。如果有非特異性產物，在加熱過程中就會出現一些比較矮，寬的峰。
5樓：匿名使用者
這個一般是用syby green作為熒光染料的時候需要做的工作！
因為syby green染料是非特異的染料，只要有擴增，染料就可以鑲嵌在雙鏈中發出熒光。我們做溶解曲線是為了觀察我們擴增發出熒光的片段是不是我們需要的產物。如果溶解曲線做出來只有單峰，且出鋒位置是你的退火溫度，那麼這個是你的產物發出的熒光，實驗結果有效。
如果出現多鋒或退火溫度不對，那麼這個實驗結果是不可信的！你需要再次調整！
如何去除熒光定量pcr 中的背景值
6樓：路戍人
背景copy校正程式測量bai
定量pcr儀所使用的反應管和水的du空白熒光強度。在zhi執行校正程式期間，定量daopcr儀在10分鐘內連續讀取背景校正板的熒光強度，訊號收集的溫度為60°c。隨後，sds軟體計算所收集到的熒光強度的平均值，提取結果並儲存到校正檔案中。
軟體在今後的分析中將自動呼叫此校正檔案，從實驗資料中扣除背景訊號。
什麼是純熒光校正，多長時間校正一次：
純熒光校正是測定各種純熒光染料標準品的波長和訊號強度，通俗地說是讓儀器「認識」各種熒光染料。軟體收集並儲存各種純熒光染料標準品的熒光資訊。以後每次定量實驗執行過程中，sds軟體收集樣品的原始光譜訊號，並將此原始光譜與純熒光檔案中的資料進行比較，精確扣除不同染料的訊號重疊部分，從而確定樣品中的熒光染料種類和訊號強度。
推薦每半年進行一次純熒光校正。在執行光譜校正之前，請先進行背景校正和roi校正。
在熒光定量PCR中SYBR Green I為什麼結合了DNA才可以發出熒光，等到結合了才能檢測到熒光值
只有在結合後，複合物的分子構型發生變化，可以吸收488nm的光能，然後發出522nm光。不結合，沒有分子構型變化，就不能吸收光能。以前我問過我們老師他說原理和跑電泳是加gvii一樣 sybr green i 含有一個可以嵌入dna堆積鹼基之間的一個三環平面基團。它與dna的結合沒有鹼基序列特異性。在...
為什麼實時熒光定量pcr做不出來,普通pcr可以
為什麼實時熒光定量pcr做不出來,普通pcr可以普通的pcr大多數是定性實驗回 而實時熒光定量pcr則定量和答定性都可以做。應用領域也不一樣,普通pcr一般應用於基因組克隆 dna測序 rna反轉錄等,而實時熒光定量pcr一般應用於mrna表達量分析 絕對定量 蛋白表達 snp分析 陰陽性解析等領域...
誰能具體解釋一下熒光定量PCR中溶解曲線的意思以及作用
這個用於syber green實時pcr。而使用探針的不需要。因為syber green是非特異性結合，所以如果有非特異性的序列被擴增，也會同樣產生訊號。在設計引物的時候，可以計算出被擴增序列的tm。pcr反應完成以後，開始進行解離曲線的測量。一般是對反應產物逐步加溫，每增加一度，測訊號一次。pcr...