1樓:匿名使用者
補充:一抗用的abcam的,1:200稀釋;
二抗用的國產的中杉金橋的,1:50稀釋的。
細胞免疫熒光失敗原因求教,細胞免疫熒光
2樓:匿名使用者
首先你應bai該確認老鼠是不是du轉基因老鼠,會不會有自zhi發熒光的產生
dao。其次,二專抗就是熒光染料,屬只要加了二抗,就會有熒光的產生,所以需要在加完二抗後用pbs洗5次,充分將多餘二抗洗掉,避免在拍片時產生躁點影響實驗結果。
如何做好免疫熒光
3樓:南京金益柏生物科技****
免疫熒光是標記免疫技術發展最早的一種,它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術,通過將抗體與一些示蹤物質結合,利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。免疫熒光步驟包括,細胞固定和通透,封閉,孵育一抗,二抗等。除了這些基本步驟,以下建議可以幫助您獲得更好的實驗結果。
1、細胞固定和通透
為達到最佳的檢測效果,細胞需要經過固定和通透。這些步驟非常關鍵,細胞和抗原需要保證最佳的結構,並利於抗體與抗原結合。通常情況下,需要通過以下步驟得以實現:
細胞用2%-4%多聚甲醛固定,之後用0.1%皁角苷或0.02%的triton x-100進行通透。
前者是比較溫柔的處理,但是對於核內抗原可能無效,需要用到triton。使用皁角苷進行通透時,要注意它會引起細胞膜的可逆性通透,也就是除了在通透初期,在每個抗體孵育環節都需要進行通透。另外,細胞可以用冰甲醇進行同時固定和通透,可以避免去垢劑的使用。
2、抗體特異性
免疫熒光需要用到特異性非常強的抗體,可以避免高背景和不理想的蛋白定位結果。在大多數情況下,純化抗體的效果很好,但是正確的對照可以幫助精準定位抗原。使用只有二抗染色的**作為陰性對照,有利於減少降低背景干擾。
3、合適的抗體稀釋比例
通過優化抗體稀釋比例來優化染色,通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達到特異性染色的結果。
但在能保證低背景染色的前提下,可以通過增加濃度來提高訊號強度。如果是第一次使用該抗體或測定某抗原,強烈建議濃度梯度實驗。
4、優化緩衝液和封閉劑
儘管很多抗原在常見的buffer如pbs中可以很好的被染色,但是對於某些目的抗原,更換一下含有不同離子的緩衝液,比如鈣、鎂、鉀等,可以帶來很大程度上的改善。rockland可提供優化過的ihc用封閉緩衝液,同樣適用於熒光染色實驗。
5、選擇正確的二抗
如果您需要做免疫實驗,我們強烈建議您選擇進行過預吸附的二抗進行單染實驗;如果是雙重甚至是多重染色,那麼必須使用預吸附的二抗。同時,請優先選擇來自同一物種的二抗。
6、使用合適的細胞密度
選擇合適的細胞數量進行染色,當細胞數量過多時,細胞結構不好,導致染色背景深,低細胞密度,會使細胞貼壁不佳,狀態不好。
7、多重染色
對同一樣本進行兩個不同抗原的檢測時,可以用各自的抗體進行同時染色,但要求兩個一抗的種屬**不同,標記物不同,而二抗的種屬**需保持一致。
8、降低背景
高背景是免疫熒光常見的問題,解決此問題可以用二抗**的正常血清代替bsa做封閉液,降低抗體濃度,增加洗滌次數,洗滌至少三次,每次五分鐘,推薦洗滌液為pbs+0.05%tween。
9、封片
作為免疫熒光的最後一步,可以提高折射率,保護樣品。
10、資料分析
觀察整體樣片時,選擇具有代表性的細胞進行資料獲取與分析。
細胞可不可以固定後放置一段時間再做免疫熒光
4樓:匿名使用者
這個沒有絕bai
對的。取決於你的試du驗方法和zhi目的。一般來說,固dao定後,把樣本再轉移回到儲存液中,可以大答大延長儲存的時間。
為了保護抗原表位,建議你使用新鮮配置的多聚甲醛來固定。固定後立刻轉移到5%bsa的pbs溶液中(最好放防腐劑),可以在4度儲存一段時間。
當然,樣本長時間儲存,肯定對結果會有不好影響。至於影響的大小,你要做一個時間曲線來證明。以後就心中有數了。
還有一點要注意的是,抗體對抗原表位的識別。有些抗體只能識別未固定的表位,有些可以識別固定後的,有些只能識別變性的肽鏈。購買的時候也要特別注意。
5樓:111尚屬首次
應該是不行的,流式一般是先抗體標記,再固定的。先用甲醛固定會影響蛋白構形,內改變抗原決定簇的三
容維構型,影響蛋白與抗體的結合,造成假陰性結果。
最好不要這樣,我們實驗室做流式沒有提前用甲醛固定過,都是收集細胞後馬上做流式。細胞如果長密了你可以凍存或者傳代,等抗體來了再做流式。
6樓:蛙家居
這個沒有絕對的.取決於你的試驗方法和目的.一般來說,固定後,把樣本再轉移到儲存專液中,可以屬大大延長儲存的時間.
為了保護抗原表位,建議你使用新鮮配置的多聚甲醛來固定.固定後立刻轉移到5%bsa的pbs溶液中(最好放防腐劑),可以在4度儲存一段時間.
當然,樣本長時間儲存,肯定對結果會有不好影響.至於影響的大小,你要做一個時間曲線來證明.以後就心中有數了.
細胞免疫熒光,求助
7樓:匿名使用者
免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結合來顯示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗結合,其次是帶有熒光基團的二抗識別並結合一抗,熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。實驗步驟如下:1、已轉染72h的細胞種於共聚焦專用培養皿裡,冰pbs洗三遍,每次5分鐘。
2、細胞半乾時,覆蓋以4%冷的多聚甲醛固定15分鐘,避光。3、吸去多聚甲醛後,用冰pbs洗三遍,每次5分鐘。4、0.
5%tritonx-100覆蓋細胞10分鐘,冰pbs洗三遍,每次5分鐘。5、與二抗相同宿主的血清?進口胎牛血清室溫封閉30分鐘。
6、配製一抗(sab2104246-50ug,sigma,usa):sab+fbs=1:200。
7、加入一抗覆蓋細胞,錫紙包裹4度避光過夜。次日:8、取出細胞復溫至室溫約1h。
9、冰1‰tween洗兩次,每次5分鐘,於搖床。冰pbs洗一次,5分鐘,於搖床。10、配製熒游標記二抗:
用pbs或fbs配製。濃度1:20011、加入二抗,室溫孵育1小時(避光)。
12、冰1‰tween洗兩次,每次5分鐘,於搖床。冰pbs洗一次,5分鐘,於搖床。13、dapi染核,每皿1滴,完全覆蓋住細胞即可。
14、冰1‰tween洗兩次,每次5分鐘,於搖床。冰pbs洗一次,5分鐘,於搖床。15、加入防熒光淬滅封片劑,避光。
16、上機confocol建議:1.還是染完之後沒有封片前直接照一些,因為有的時候可能封片會出現問題,再想照反而沒有了,另外不要拖太長時間,熒光會淬滅的。
2.熒光的**一定要避光儲存,儲存的好的話,過一段時間仍然能照出很好的**。3.
二抗用之前一定離心,不然有的時候有那種沉澱,在**上就是一個很大的非特異性熒光光點,非常難看。4.不管採用何種方法,在使用pbs緩衝液漂洗時,如果結果背景較高可以延長漂洗的次數和時間。
穩定轉染之後細胞熒光強度差異很大怎麼辦?
8樓:匿名使用者
理論和抄實際有差別是正常的。也許是受bai表達蛋白和gfp等熒光蛋白之間的相du互影zhi響,有時候,熒光強的dao細胞,你的目的基因的表達並不見的高,反而一些有熒光但熒光強度不高的目的基因的表達較高。你可以通過western blot去驗證。
另外,穩定克隆也不是能使用下去,即使你一直使用篩選藥物,如g418,因為隨著傳代的增多,會有丟失導致表達量下降,因此,穩定克隆在傳6-7代以後或許就應該重新篩選。
更多相關問題可以登入生物幫看看生化實驗技術,試劑配製,酶學實驗,生化實驗,酶學實驗技術。
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細胞免疫熒光的詳細du操作步zhi驟 1,取出細胞爬片放到35mm或60mm用過dao的細胞內培養皿裡,pbs洗三遍。注意容有的時候作的細胞爬片可能比較小,因此夾取的時候要小心。2,4 多聚甲醛固定20分鐘,pbs洗三遍。3,0.2 triton x 100通透10分鐘,pbs洗三遍。4,與二抗相同...
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細胞免疫熒光記得先上圖,要不我們也不知道如何幫你啊,對吧 細胞免疫熒光,求助 細胞爬片免疫熒光實驗步驟 第一天 1.在培養板中將已爬好細胞的玻片用pbs浸洗3次,每次3min 2.用4 的多聚甲醛固定爬片15min,pbs浸洗玻片3次,每次3min 3.0.5 triton x 100 pbs配製 ...
求助 細胞免疫熒光檢測病毒是否能夠定量
要看陽性對照和陰抄性對照，陰性對照沒有熒光，陽性對照有熒光，重複一次結果穩定的話就可以說是陽性了。樣品的稀釋度要看蛋白的表達量，用你們實驗室的標準protocol先做一遍，結果不好再優化條件。定量是可以的，要做western blot和elisa，但也只是相對定量，不是絕對定量，把你檢測的結果儲存一...