1樓:南京金益柏生物科技****
我做dab顯色時遇見過,切片沒有充分接觸到抗體。
tunel以及免疫熒光同時做的結果,求助
2樓:南京金益柏生物科技****
實驗條件應該沒有問題,表達位置也是對的,加強洗滌降低背景,**拍攝條件優化一下試試看。
免疫熒光的方法有什麼注意環節
3樓:南京金益柏生物科技****
1、冰凍切片製備:建議用新鮮組織,否則組織細胞內部結構破壞,易使抗原彌散。選用乾淨鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等,防止裂片和脫片嚴重。
2、組織切片固定:切好片風乾後立即用冰丙酮等固定液進行固定 5-10 min,尤其要較長時間儲存的白片,一定要及時固定和適當儲存。
3、血清封閉:為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合,需要在一抗孵育前先用血清(與二抗**一致)封閉,減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的,一般 10-30 min。
5、二抗孵育條件:二抗一般室溫或 37°C 立即觀察,若將標本放在聚乙烯塑料袋中 4°C 30 min-1h,具體時間需要摸索,而濃度一般有工作液,若是濃縮液還要摸索濃度,切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下,然後去摸索一抗濃度和孵育時間。
最後,熒光素標記的二抗隨著儲存時間的延長,可能後有大量的遊離熒光素殘留,需要注意配製時小包裝和並進行適當的離心。
6、復染:目的是形成細胞輪廓,從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用 dapi 復染。
7、封片:為了長期儲存,我們一般用緩衝甘油等封片,此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡,方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液,然後一手拿住蓋片某一拐角,而另一手拿對面的那個拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接觸到液體時為止;當發現液體接觸面在不斷彌散時,則可以緩慢降低另一拐角,這樣一般不會產生氣泡。
8、切片清洗:為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色,所以適當地加強清洗(延長時間和增多次數)尤為重要,我一般在一抗孵育前的清洗是 3 min*3 次,而一抗孵育後的清洗均為 5 次*5 min。注意:
單獨沖洗,防止交叉反應造成汙染。溫柔沖洗,防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式;沖洗的時間要足夠,才能徹底洗去結合的物質。
pbs 的 ph 和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓,當時我買的抗體稀釋液偏酸,結果背景一片黃(未見特異性染色),建議 ph 在 7.4-7.
6 濃度是 0.01 m。(中性及弱鹼性條件(ph7-8)有利於免疫複合物的形成,而酸性條件則有利於分解;低離子強度有利於免疫複合物的形成,而高離子強度則有利於分解)
9、拍照:有條件的話最好立即拍照,若不能及時拍照,也要封好片和用指甲油封固,保持避光和溼度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作,不要隨意改變程式;應在暗室中進行檢查;防止紫外線對眼睛的損害,在調整光源時應戴上防護眼鏡;檢查時間每次以1~2 h 為宜,超過 90 min,超高壓汞燈發光強度逐漸下降,熒光減弱;標本受紫外線照射 3~5 min 後,熒光也明顯減弱或褪色;激發光長時間的照射,會發生熒光的衰減和淬滅現象;所以最多不得超過 2~3 h;熒光顯微鏡光源壽命有限,標本應集中檢查,以節省時間,保護光源。
天熱時,應加電扇散熱降溫,新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅後欲再啟用時,須待燈光充分冷卻後才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。
關閉汞燈至少在開啟 15-30 分鐘後;標本染色後立即觀察,因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中 4°C 儲存,可延緩熒光減弱時間,防止封裱劑蒸發;使用的玻片等載體,都必須厚度均勻,無明顯的自發熒光,如果使用油鏡,還必須保證鏡油為無熒光鏡油;電源最好裝穩壓器,否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命,也會影響鏡檢的效果。
做免疫熒光的抗體能用來做流式嗎
4樓:南京金益柏生物科技****
免疫熒光是直接染bai色還是間接
du法?我覺得你是想用zhi熒游標dao記的抗ngf/cox-2抗體來做直接染版色,這樣的話可以在流式權上試試。但是一般免疫熒光是用間接法,這樣的話熒光抗體只anti某個種屬的抗體(視一抗而定),不是anti ngf或cox-2的,這樣就不能用於流式了。
如果一個抗體可以用來「做western blot,免疫熒光,免疫共沉澱,elisa」,我估計著是hrp或鹼性磷酸酶或生物素之類標記的,然後需要再加熒游標記的二抗,這類抗體也是不能做流式用的。
我只用過流式的抗體來做免疫熒光(直接染色),效果還不錯,但是反過來就沒試過。
求助免疫熒光的結果分析
5樓:南京金益柏生物科技****
可以用image-pro plus分析灰度
求教關於免疫熒光的問題
6樓:南京金益柏生物科技****
首先你應該確認老鼠是不是轉基因老鼠,會不會有自發熒光的產生。其次,二抗就是熒光染料,只要加了二抗,就會有熒光的產生,所以需要在加完二抗後用pbs洗5次,充分將多餘二抗洗掉,避免在拍片時產生躁點影響實驗結果。還有,確認二抗的種屬與封閉液中的某血清是否為同一類,不是同一類也會產生躁點的。
最後,是否為拍片是鐳射強度過大,尤其是第二種產生的綠色熒光均為躁點啊
細胞免疫熒光,求助
7樓:南京金益柏生物科技****
細胞免疫熒光記得先上圖,要不我們也不知道如何幫你啊,對吧
細胞免疫熒光,求助
8樓:南京金益柏生物科技****
細胞爬片免疫熒光實驗步驟
第一天:
1. 在培養板中將已爬好細胞的玻片用pbs浸洗3次,每次3min;
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min, pbs浸洗玻片3次,每次3min;
3. 0.5%triton x-100( pbs配製 )室溫通透20min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟);
4. pbs浸洗玻片3次,每次3 min,吸水紙吸乾pbs,在玻片上滴加正常山羊血清,室溫封閉30min;
5. 吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗並放入溼盒,4°C孵育過夜;
第二天:
6. 加熒光二抗: pbst 浸洗爬片3次,每次3min,吸水紙吸乾爬片上多餘液體後滴加稀釋好的熒光二抗,溼盒中20-37°C孵育1h,pbst浸洗切片3次,每次3min;
注意:從加熒光二抗起,後面所有操作步驟都儘量在較暗處進行。
7. 復染核:滴加dapi避光孵育5min,對標本進行染核,pbst 5min×4次洗去多餘的dapi;
8. 用吸水紙吸乾爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,然後在熒光顯微鏡下觀察採集影象。
細胞免疫熒光求助,求助細胞免疫熒光的詳細操作步驟
細胞免疫熒光的詳細du操作步zhi驟 1,取出細胞爬片放到35mm或60mm用過dao的細胞內培養皿裡,pbs洗三遍。注意容有的時候作的細胞爬片可能比較小,因此夾取的時候要小心。2,4 多聚甲醛固定20分鐘,pbs洗三遍。3,0.2 triton x 100通透10分鐘,pbs洗三遍。4,與二抗相同...
請教這個免疫熒光的結果怎麼看,免疫熒光結果怎麼表達
很可能做雙染的,感覺常用的只有綠色和紅色,再加上染核的藍色。但是要注意後續染色的時候二抗的熒光不要跟質粒攜帶的熒光的顏色一樣。免疫熒光結果怎麼表達 這個比較省事兒的是用組織晶片做免疫組化,直接打分。比單張的組織切片更有說服力。求助免疫熒光的結果分析 可以用image pro plus分析灰度 各位做...
做間接法免疫熒光染色，如何設定對照
1 空白對照 如果你做的是石蠟切片免疫組化，這個對照必須有，目的是看自版發熒光，脫權蠟後直接在熒光顯微鏡下觀察。2 陰性對照 標本直接滴加二抗，呈陰性反應。3 抗原對照 標本加同種動物的未免疫血清，以pbs沖洗後，在加抗免疫球蛋白熒光抗體。因未免疫動物的血清中無特異性抗體，應呈陰性反應。生物幫上面有...