1樓:匿名使用者
為什麼實時熒光定量pcr做不出來,普通pcr可以普通的pcr大多數是定性實驗回
,而實時熒光定量pcr則定量和答定性都可以做。應用領域也不一樣,普通pcr一般應用於基因組克隆、dna測序、rna反轉錄等,而實時熒光定量pcr一般應用於mrna表達量分析、絕對定量、蛋白表達、snp分析、陰陽性解析等領域。不是定量pcr比pcr好,而是兩者應用與不同的領域,起到了不同的作用。
熒光定量pcr較普通pcr不同的一點就是可以實時檢測pcr擴增產物,從而可進行絕對定量或者相對定量。
實時熒光定量pcr與普通pcr的區別是什麼?結果有何異同?能說明的問題是什麼?
2樓:麼破1自我
二者結果相同。都能說明生物體外的特殊dna複製的整個過程的擴增效率和溶解溫度情況。
區別:1、二者系統組成不同
熒光定量pcr儀比普通的pcr儀多了熒光訊號採集系統和計算機分析處理系統。
2、二者原理不同
熒光定量pcr實時監測與dna結合的熒光染料激發的熒光,普通ocr通過檢測插入dna中核算染料的量來測定pcr最終產物量。
3、二者反應要求不同
熒光定量pcr對擴增片段有較高的要求,一般為100-300bp,普通pcr可以擴增長點的片段。
4、二者應用不同
熒光定量pcr主要是用來定量分析和確定基因轉錄水平的,普通的pcr儀是做定性分析和擴增基因片段,定量pcr儀可以做普通pcr儀的工作,反之不行。
5、二者測量成本不同
定量pcr儀**較為昂貴,普通的基因擴增儀(pcr儀)只能夠定性地分析是否存在目標片段。但是**要低很多,而且執行成本也要低很多。
實時熒光定量pcr技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的侷限,實現了每一輪迴圈均檢測一次熒光訊號的強度,並記錄在電腦軟體之中,通過對每個樣品ct值的計算,根據標準曲線獲得定量結果。
3樓:匿名使用者
原理不同:熒光定量pcr實時監
測與dna結合的熒光染料激發的熒光;普通pcr通過檢測插入dna中核算染料的量來測定pcr最終產物量,一般是紫外光。
反應要求:熒光定量對擴增片段有較高的要求,一般為100-300bp;普通定量可以擴增長點的片段。如果不需要檢測產物分子量大小,熒光定量可以不進行電泳就對產物進行定量分析,普通pcr必須電泳。
結果:熒光定量可以實現精確定量,普通pcr則不行。熒光定量體現可以看到整個擴增過程,可以看到擴增效率,溶解溫度,直接得到的標準曲線等,這些是普通pcr無法實現的。
如果還不清楚建議去丁香園等**逛逛,希望可以幫到你
4樓:匿名使用者
所謂實時熒光定量pcr技術,是指在pcr反應體系中加入熒光基團,利用熒光訊號積累實時監測整個pcr程序,最後通過標準曲線對未知模板進行「定量分析」的方法。
記住,實時熒光定量是定量分析
5樓:匿名使用者
熒光pcr是為了測量mrna表達量的 普通pcr是為了擴增目的片段的
6樓:匿名使用者
熒光定量是定量的,普通pcr是定性的,結果一個是說明含有多少,另一個說明有還是沒有,前者更精確一點
實時熒光定量pcr與基本pcr相比有什麼優點
7樓:杏雀烈
熒光定量pcr與普通pcr相比具有以下優點:
1、高靈敏性 可檢測單個細胞基因;
2、高特異
8樓:匿名使用者
普通的pcr大多數是定性實驗,而實時熒光定量pcr則定量和定性都可以做。應用領域也不一樣,普通pcr一般應用於基因組克隆、dna測序、rna反轉錄等,而實時熒光定量pcr一般應用於mrna表達量分析、絕對定量、蛋白表達、snp分析、陰陽性解析等領域。不是定量pcr比pcr好,而是兩者應用與不同的領域,起到了不同的作用。
熒光定量pcr較普通pcr不同的一點就是可以實時檢測pcr擴增產物,從而可進行絕對定量或者相對定量。
9樓:奔馬的香香豬
pcr實驗主要採用sybr green染料法和taqman探針法,biog技術採用經化學修飾的熱啟動聚合酶,有效避免了非特異擴增,具有高度的特異性。反應緩衝液經多次優化,與熱啟動聚合酶具有最為樂觀的搭配,使聚合酶的活效能夠得到最大程度的發揮。反應靈敏快速,40個迴圈只需20多分鐘的時間。
在20ul的反應體系裡,只要有幾個拷貝的dna分子就能被檢測出來。
實時熒光定量pcr 引物與普通pcr一樣嗎
10樓:匿名使用者
實時定量的引物設計要求比較高,可以按普通引物設計的方法來做,但是設計時要注意擴增的片段不能太大,最好在250bp-100bp之間。同時要保證這對引物有絕對的特異性,因為要是產生非特異性擴增的話,就不能準確的計量模板量了,這樣就失去了實時定量的意義了
11樓:匿名使用者
不是一回事 熒光pcr是為了檢測mrna表達水平 所以只要在整條mrna上選取特異性好的一段兩百bp左右的序列擴增就可以了 普通pcr是為了擴增特定的片段或者基因 設計在哪是要看你需要擴增哪部分的
12樓:匿名使用者
熒光是定量判定起始模板濃度的..跟普通pcr引物是一樣的 不同的只是反應中加入了探針或者燃料用於實時監控~!
pcr和實時熒光定量pcr這兩種有什麼區別
13樓:
原理不同:熒光定量pcr實時監測與dna結合的熒光染料激發的熒光;普通pcr通過檢測插入dna中核算染料的量來測定pcr最終產物量,一般是紫外光.
反應要求:熒光定量對擴增片段有較高的要求,一般為100-300bp;普通定量可以擴增長點的片段.如果不需要檢測產物分子量大小,熒光定量可以不進行電泳就對產物進行定量分析,普通pcr必須電泳.
結果:熒光定量可以實現精確定量,普通pcr則不行.熒光定量體現可以看到整個擴增過程,可以看到擴增效率,溶解溫度,直接得到的標準曲線等,這些是普通pcr無法實現的.
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14樓:汗耕順閔凰
熒光原位雜交和熒光定量pcr有什麼區別
實時熒光定量pcr技術,是指在pcr反應體系中加入熒光基團,利用熒光訊號積累實時監測整個pcr程序,最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
pcr(聚合酶鏈式反應)是利用dna在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈,低溫(經常是60°c左右)時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合,再調溫度至dna聚合酶最適反應溫度(72°c左右),dna聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。
恆溫pcr和實時熒光定量pcr的不同,是不同在實時熒光定量pcr的系統中加入了熒光染料(sybr
green
或taqman
探針等等)。以sybr
green為例,這種染料可以結合在雙鏈的dna上,當pcr不斷進行時,每一次退火生成的雙鏈dna也在增加,熒光染料結合也越多,熒光也越強。在機器中有一個探測熒光的探頭,可以定量檢測熒光的強度,轉換成數值。這樣就可以實時記錄反映體系中dna的反應情況。
熒光pcr更有優勢,因為熒光pcr靈敏度高於恆溫pcr,同樣**也高一些。
實時熒光定量pcr的結果該怎樣分析?
15樓:群英鬥將
1、如果有標準曲線,按照標準曲線計算;
2、一般都是相對量,則用delta delta ct方法來計算;
3、引物或探針降解:可通過page電泳檢測其完整性;
4、模板量不足:對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;
5、看ct值是分析熒光定量pcr最直觀的一個資料,ct值一般在35左右就失去參考價值了,平時我們實驗室用biodai-pcr熒光定量法測得的擴增曲線的起跳值基本在30左右。
擴充套件資料:
pvr的迴圈引數:
1、預變性;
模板dna完全變性與pcr酶的完全啟用對pcr能否成功至關重要,加熱時間參考試劑說明書。
2、變性步驟;
迴圈中一般95°C,30秒足以使各種靶dna序列完全變性,可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性,過短靶序列變性不徹底,易造成擴增失敗。
3、引物退火;
退火溫度需要從多方面去決定,一般根據引物的tm值為參考,根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對pcr的特異性有較大影響。
4、引物延伸;
引物延伸一般在72°C進行(taq酶最適溫度)。但在擴增長度較短且退火溫度較高時,本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定,一般推薦在1000bp以上,含pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。
5、迴圈數;
大多數pcr含25-35迴圈,過多易產生非特異擴增。
6、最後延伸;
在最後一個迴圈後,反應在72°C維持10-30分鐘.使引物延伸完全,並使單鏈產物退火成雙鏈。
16樓:南京金益柏生物科技****
用2-△△ ct法算的話,應如何算? 假設檢測a基因,ct分別為(這裡記住ct越大,表明相對含量越低) 普通組/test1:28 實驗組1/test2:
29 實驗組2/test3:30 這時候要設對照了,假設test1為對照組(普通組),當然是以普通組為對照 那麼,相對含量為。
17樓:匿名使用者
看ct值、起始拷貝數、標準偏差等
如果是sybr做的話,再看下溶解曲線
請問做實時熒光定量pcr實驗時,為什麼做標準曲線?
18樓:匿名使用者
1 做標曲才可以算出這對引物的擴增效率(其斜率),方便用pfaffl方法來進行相對定量(得到的結果相對精確一點),否則只能預設擴增效率為2,用2^-ddct(livak)法來計算
2 做標曲才可以絕對定量。
19樓:匿名使用者
標準曲線是已知量的
做了標準曲線可以實現絕對定量
20樓:匿名使用者
絕對定量和相對定量都可以做標準曲線,目的在於用已知濃度樣品的量做成的標準曲線來定未知濃度樣品的量。
實時熒光定量pcr中什麼可以不需要延伸階段
21樓:匿名使用者
1.sybrgreeni法:
在pcr反應體系中,加入過量sybr熒光染料,sybr熒光染料特異性地摻入dna雙鏈後,發射熒光訊號,而不摻入鏈中的sybr染料分子不會發射任何熒光訊號,從而保證熒光訊號的增加與pcr產物的增加完全同步。
sybr定量pcr擴增熒光曲線圖
pcr產物熔解曲線圖(單一峰圖表明pcr擴增產物的單一性)2.taqman探針法:
探針完整時,報告基團發射的熒光訊號被淬滅基團吸收;pcr擴增時,taq酶的5』-3』外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光訊號,即每擴增一條dna鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光訊號的累積與pcr產物的形成完全同步。
實時熒光定量pcr是否能需要延伸
1.sybrgreen 法 在pcr反應體系中，加入過量sybr熒光染料，sybr熒光染料特異性地摻入dna雙鏈後，發射熒光訊號，而不摻入鏈中的sybr染料分子不會發射任何熒光訊號，從而保證熒光訊號的增加與pcr產物的增加完全同步。sybr定量pcr擴增熒光曲線圖 pcr產物熔解曲線圖 單一峰圖表明...
乙肝病毒HBV DNA實時熒光定量PCR檢測結果是1 79E
不知道你是不是首次發現肝功能不正常。如果是建議你觀察兩三個月再說。每個月檢查一次肝功能，如果穀草轉氨酶 谷丙轉氨酶持續升高超過80，那麼就可以進行抗病毒 了。抗病毒 你要做好長期抗戰的準備。dna6次方屬於中等偏上，很正常的情況，無需給自己太大壓力。找個三甲醫院看病，以免被騙。這份結果是黃疸型肝炎與...
實時熒光定量pcr因子表達量越少ct值越小嗎
看了你空間裡的溶解曲線，你可以看到溶解峰的溫度都很低，全在80以下，你擴出來的東西多半隻是引物，你跑定量的時候有做ntc的孔嗎，如果有做，可以對照ntc組和加了模板的組，溶解峰還是一樣的話，那你擴出來的產物100 是引物了。再有，你的擴增曲線問題，ct太了，一般做定量認為ct 25時，是一個模板擴出...