1樓:瑞棟璇淼
通用來引物加特異性引物源菌落pcr+質粒雙酶切 均陽bai性 具特異性證明(縫拼接除du外)
認雙酶切實驗能夠zhi更嚴謹驗證重組實dao驗 更具說服力基組測序知道您重組質粒否酶切解環與線性空載體進行比 瓊脂糖凝膠電泳本身存定範圍內誤差 若目片段 立體dna結構瓊脂糖凝膠誤差放 能影響實驗結
根據您實驗結 我猜測重組質粒陰效能性更些
既已經抽提質粒 妨做質粒pcr雙酶切 品塊凝膠內平行跑結目
菌落pcr會出現假陽性結果嗎
2樓:匿名使用者
高手們好。最近做酶切連線轉化,最後做鑑定時,以菌落為模板進行pcr時可以見到有目的條帶;當把菌落接種到lb液擴菌後,以菌液為模板進行pcr時卻什麼東東都沒有?請問會是什麼原因啊?
多多指教啊!建議重新以菌落為模板進行pcr檢測,再重新以菌液為模板進行pcr檢測,因為菌落或者菌液pcr假陽性的機率還是比較高的。但如果還是出現以上結果,推測很可能是平板上殘留的連線液中的未連線上載體的目的條帶引起的,此時建議再提質粒做pcr檢測和酶切檢測來徹底證明你的目的片段是否真正與載體連線成功。
個人的見解希望對你有所幫助,也期望高手們批評指正!我覺得菌落pcr效果很好,雖然有假陽性的可能,但是只要是做出來,有目的條帶一般是對的,你為什麼還要用菌液做pcr?你還不如搖菌後提取質粒然後用質粒pcr或者酶切。
既然你說到這個問題了,我覺得很有可能是你的質粒被稀釋了,因為在菌落中的濃度比較大。另外也有可能是你根本就沒有挑到正確的菌落來搖菌,所以就沒有質粒,怎麼能做出來。我覺得你做菌液的pcr和菌液的pcr必須是從單一的一個菌落挑出來的,如果不是,那肯定只有一個是正確的,我做過,只要是同一菌落不會有差錯。
你再試試看,祝你成功!謝謝各位高手的及時的回答。現在我都是挑單個菌落後搖菌,然後提取質粒,然後以質粒為模板做pcr,陽性的質粒再酶切進行鑑定,效果還可以。
再次謝謝大家!!!第二次看到這種觀點,不確定對不對,借道跟大家討論一下,不知道lcc有沒有文獻支援一下這種觀點?如果這種觀點正確,那我以前很多關於t載體的看法就錯了,所以很感興趣。
我一直以為外面的dn**段會被大腸桿菌分泌出來的核酸酶降解。 lcc_0 wrote:推測很可能是平板上殘留的連線液中的未連線上載體的目的條帶引起的說來也很奇怪,以前我就是挑菌後加到lb液後搖菌,然後以菌液為模板進行pcr,再以陽性管提取質粒進行酶切鑑定,排除陰性管,這樣可以少提一些質粒。
最近菌液pcr總是陰性,所以就直接提質粒進行鑑定了。其中原因真的不知道是什麼?我也遇到過,也許是塗抹的轉化產物導致的加陽性(菌落pcr)。
各位大大,我倒是碰到過菌液pcr是陰性,但是有質粒的情況,酶切也正確。一般我以為質粒抽屜和酶切鑑定是最保險的。pcr假陽性。
假陰性的概率都很高。菌液的問題在於鹽!鹽會干擾pcr。
如果用菌液的話,可以用水洗滌離心幾次,然後重懸於水,就可以了。 題外話:最近菌落pcr,陰性和陽性對照經常不擴增,而樣品擴增,鬱悶啊。
3樓:匿名使用者
條帶兩端上揚這種情況在跑電泳很常見,一般把電壓調低點跑久點會改善,有時候膠沒有做好也會出現這樣的情況,注意拔梳子的時候一定要平衡。以前做克隆的時候,陰性對照模板用水擴增也出現過有條帶,就像你最後一個泳道。老闆說是汙染了,把所有的試劑全部換新的,而且加樣條件也非常注意,後來就沒有條帶了。
4樓:匿名使用者
菌落pcr的結果參考價值比較下,假陽性太厲害。還是以測序結果為準。可以在測序之前做一下質粒酶切驗證
質粒酶切前後電泳結果有什麼不同，PCR產物和質粒雙酶切後電泳如何判斷酶切完成？
如果是單酶切，超螺旋質粒會變成開鏈dna，開鏈的dna在凝膠中泳動速度慢於超螺旋質粒，因此條帶會偏大，這是酶切充分的情況。如果不充分，就會有大小有差距的幾條帶 如果是雙酶切，而且片段大小適中，可以看見酶切的片段和載體，還有未切開的質粒。能不能區分超螺旋質粒和開鏈質粒，和所用瓊脂糖凝膠的濃度，電泳時間...
古菌pcr陰性對照為什麼有條帶,古菌PCR陰性對照為什麼有條帶
說明引物有非特異性擴增。所以,當你的樣品中出現一模一樣的條帶的時候,要小心了,說明這條帶可能是非特異性擴增引起的。為什麼pcr陰性總有條帶出現 提高退火溫度,或重新設計引物,或者是陰性對照被汙染,當然還有其它好多小原因,要是還沒解決,請細說並追問。為什麼我的pcr陰性對照總是跑出陽性條帶 實驗室體系...
PCR技術獲取目的基因時為什麼要至少經過3次迴圈才能從DNA
一般需要獲bai得的基因是有一du定長度的，zhi而模板長度很長。設計的引物dao決回定了擴增產物的長度。第一答個迴圈，引物與模板互補，此時變成兩個模板，但因為模板很長，沒有什麼終止擴增，所以第一個迴圈擴增出來的新片段很長很長。第二個迴圈以新的長片段為模板進行，但新片段的一端是引物開頭的，所以第二個...