1樓：初芯_不變
提取某一特定蛋白質的一般程式可以分為前處理、粗分級、細分級三步。
前處理提取某種蛋白質，首先要把蛋白質從原來的組織或細胞中以溶解的狀態釋放出來並保持原來的天然狀態，不丟失生物活性。為此，動物材料應先剔除結締組織和脂肪組織，種子材料應先去殼甚至去種皮以免受單寧等物質的汙染，油料種子最好先用低沸點的有機溶劑如乙醚等脫脂。然後根據不同的情況，選擇適當的方法，將組織和細胞破碎。
動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿機破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細胞由於具有纖維素、半纖維素和果膠等物質組成的細胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和適當的提取液一起研磨的方法或用纖維素酶處理也能達到目的。細菌細胞的破碎比較麻煩，因為整個細菌細胞壁的骨架實際上是一個借共價鍵連線而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。
破碎細菌細胞壁的常用方法有超聲波破碎，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。組織和細胞破碎後，選擇適當的緩衝液把所要的蛋白提取出來。細胞碎片等不溶物用離心或過濾的方法除去。
如果所要的蛋白主要集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體或可溶性細胞質等，則可利用差速離心的方法將它們分開，收集該細胞組分作為下步提取的材料。如果碰上所要蛋白是與細胞膜或膜質細胞器結合的，則必須利用超聲波或去汙劑使膜結構解聚，然後用適當介質提取。
粗分離當蛋白質提取液(有時還雜有核酸、多糖之類)獲得後，選用一套適當的方法，將所要的蛋白與其他雜蛋白分離開來。一般這一步的分離用鹽析、等電點沉澱和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點是簡便、處理量大，既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白溶液。
有些蛋白提取液體積較大，又不適於用沉澱或鹽析法濃縮，則可採用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空乾燥或其他方法進行濃縮。
細分離樣品經粗分級分離以後，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進一步提取，一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時還可選擇電泳法，包括區帶電泳、等電點聚焦等作為最後的提取步驟。
用於細分級分離的方法一般規模較小，但解析度很高。
結晶是蛋白質提取的最後步驟。儘管結晶過程並不能保證蛋白一定是均一的，但是隻有某種蛋白在溶液中數量上佔有優勢時才能形成結晶。結晶過程本身也伴隨著一定程度的提取，而重結晶又可除去少量夾雜的蛋白。
由於結晶過程中從未發現過變性蛋白，因此蛋白的結晶不僅是純度的一個標誌，也是斷定製品處於天然狀態的有力指標。
離子層析法
當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變ph等辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。
有機溶劑提取
蛋白質提取有機溶劑提取的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、ph值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以提取蛋白質。例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而提取冰核蛋白。
由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性。因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止區域性濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決。對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液。
冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由cohn於2023年提出,用於製備丙種球蛋白。冷乙醇法也是who規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用。
2樓：匿名使用者
（一）水溶液提取法
稀鹽和緩衝系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利於蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方面，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利於溶解，縮短提取時間。
但另一方面，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此，基於這一點考慮提取蛋白質和酶時一般採用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
（二）有機溶劑提取法
一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶於水、稀鹽溶液、稀酸或稀鹼中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度範圍內（度為10%，40度為6.
6%）不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的ph及溫度選擇範圍較廣，也適用於動植物及微生物材料。
3樓：北京華瑞昌盛
美國有個試劑盒，離心管柱法總蛋白提取試劑盒sd001，只需要把樣本放入離心管裡離心30秒即可獲得全部總蛋白，操作極其簡單。
4樓：化晴子
pbs是磷酸緩衝液。為了防止ph值過於劇烈的變化而造成蛋白質變性。
一般蛋白質在水性溶液中就能溶解。不知你做的是什麼蛋白?如果是變性蛋白則可能不溶。不同ph的pbs是應為在不同的提取步驟中的最適ph是不同的。
我說的水溶性蛋白是指一般的蛋白質。人體**表面是角蛋白，這類蛋白不溶於水。
我強烈懷疑你沒有學過基礎的生物學化學原理。
5樓：匿名使用者
若為胞內可溶性蛋白，需使用破胞法（如超聲裂解），使內容物釋放，然後採用柱層析等步驟提取；若為胞內包涵體，細胞破碎後，離心，收集沉澱，採用變性/復性方法，獲得純度較高的蛋白；
若為胞外蛋白，需富集濃縮，再用常規方法提取。
蛋白質提取問題
植物組織蛋白質提取用什麼方法
6樓：老王賣瓜了
1、根據樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液,可根據材料不同適當加入）,準備提取液放在冰上.
2、把樣品放在研缽中用液氮研磨,研磨後加入提取液中在冰上靜置（3-4小時）.
3、用離心機離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清夜,樣品製備完成.蛋白質提取液：300ml1、1mtris-hcl（ph8） 45ml2、甘油（glycerol）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrordone）6g這種方法針對sds-page,垂直板電泳!
請教：如何提取細胞內的蛋白並定量
7樓：匿名使用者
一般來說檢測細胞內的蛋白質需要破碎細胞，非結構蛋白較易提取，破碎細胞後離心取上清即可。而結構性蛋白則需破碎脂膜提取蛋白，具體方法可參照膜蛋白提取的相關文獻。提取的總蛋白需定量，然後以每mg或g的蛋白的相同濃度稀釋後用於測定。
提取時注意要保持低溫及加入必要蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)。
可以，這個和western定量的原理類似，需要有標準品來作比對。不過很難。因為流式主要是用來最相對量的比較的。
細胞內的蛋白，用熒游標記的單克隆抗體識別後，用流式可以測出每個細胞的相對熒光強度。有一種特異性的微球，可以吸附一系列不同定量分子數的抗體。這種微球吸附同樣的熒光抗體，可以做出熒光強度和所吸附抗體分子數量的標準曲線。
然後拿細胞檢測的熒光強度和這個標準曲線對比，得到細胞內所結合的抗體數。因為單克隆抗體只結合相同的抗原表位，所以可以推算出細胞內蛋白的分子數量了。
解釋結果的時候要考慮到抗體的特異性和染色的效果等影響因素。
真菌蛋白質提取的步驟
8樓：匿名使用者
植物組織蛋白質提取方法 1、根據樣品重量（1g 樣品加入 3.5ml 提取液，可根據材料不同適當加入）， 準備提取液放在冰上。 2、把樣品放在研缽中
9樓：冷戀甜品_布
是酵母嗎，可以使用上海生工的一步法酵母活性蛋白提取試劑盒 bsp026
10樓：匿名使用者
可以試一試用trizol提取~~
求教用於elisa的細胞內蛋白提取方法
11樓：南京金益柏生物科技****
我曾經bai做過，細胞用超聲
低溫du裂解後離心得到上zhi
清。我用超聲dao低溫裂解細胞的，然後回離心答得到上清做elisa建議用流式檢測，不要用elisa法。
但是檢測胞內蛋白時，需要先固定打孔細胞，然後再標記熒光素偶聯抗體，這時抗體就可以進入細胞內從而檢測胞內蛋白。
如調節性t細胞的特異轉錄因子foxp3，細胞訊號轉導過程中的一些活化的激酶等都可以用流式的方法檢測。
12樓：
既然能做考染 不就直接跑western麼。。。 就可以用內參歸一化了 elisa的話直接測下總蛋白濃度呢 雖然一般都不太準
western提取組織核心蛋白方法
13樓：匿名使用者
其實和抽提普通蛋白不同的地方就在於要將核蛋白和胞漿蛋白分開。所以使用的裂解液既不能太劇烈，否則會在同一時間將胞膜和核膜都溶掉，導致核蛋白和胞漿蛋白混在一起，起不到分離的作用，也不能太溫和，不然胞膜破了，核膜還完整，也分離不出核蛋白。
常規有人會做密度梯度離心法，通過長時間高速離心，先把細胞核分離出來，再從核裡面去提蛋白。不過時間挺長的，做起來也麻煩。
我們實驗室做的時候，都是買分離試劑盒來做，好像是pierce的ne-per還是什麼，可以先裂胞膜，收集胞漿蛋白以後，再裂核膜，分離核蛋白。做起來還是很快的，反正比超速離心的方法要簡單。
14樓：匿名使用者
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