1樓:唯愛
轉化a.將-70 0c下保bai存的感受態細胞(
du200μl),室溫下
zhi解凍後放置於冰上。dao
b.將nd-pucm-t質粒dna溶液(不超過50ng)或回pcr產物與pucm-t質粒的答連結產物,體積不超過10μl,輕輕搖勻,冰上放置30min。
c.42 0c水浴中熱擊90s或370c水浴中熱擊5min,熱擊後迅速置於冰上冷卻3-5min。
d.向管中加入預熱的1 ml lb液體培養基(不含ampr),混勻後370c下**培養1小時使細胞恢復正常生長狀態,並表達質粒編碼的抗生素抗性基因(ampr)。
e.取上述菌液20-100l塗布於含amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,等菌液完全乾後倒置平皿370c下培養16-24hr。
對照 1:以蒸餾水代替puc質粒dna,其它同上。
對照 2:以蒸餾水代替puc質粒dna,在步驟e 中,取5μl塗布於不含amp的篩選平板上。
計算:轉化子總數=菌落數×稀釋倍數×轉化反應總體積/塗布體積
轉化頻率= 轉化子總數/質粒dna量
感受態細胞總數=對照2菌落數×稀釋倍數×菌液總體積/塗板菌液體積
感受態細胞轉化效率=轉化子總數/感受態細胞總數
為什麼大腸桿菌感受態細胞製備和轉化
2樓:元霜
轉化實驗用bai液態的lb是為了讓細du胞恢復培
zhi養,也有人稱
之為讓其孵育,質dao粒或其他經專在液態lb中恢復屬培養後再塗布平板(固態培養基),是為了分散開,以培養單克隆。一般經37度倒置培養12-16h後,就可以看到有單個克隆長出,就可挑取了。
大腸桿菌感受態細胞轉化實驗中冰浴的作用是什麼?
3樓:匿名使用者
冰浴過程中,原來加在溶液中的鈣離子和細菌細胞膜結合,在低溫下形成液晶結構,這樣,在42度熱激下,這種液晶結構收縮,將細胞膜扯開孔道,使dna進入細菌細胞中。這就是原理。 前面冰浴不清楚,熱激我認為是讓已經有孔的大腸桿菌孔膨脹,增加dna進入的機率,然後立刻冰浴,使孔收縮,進去的dna不要出來。
個人想法,沒看到過類似文獻。
你在ncbi上查查第一個利用大腸桿菌轉化的人,他是怎麼做的。文獻裡肯定有原理說明,不過可能是幾十年前的文獻了。
4樓:匿名使用者
前面冰浴不清楚,熱激我認為是讓已經有孔的大腸桿菌孔膨脹,增加dna進入的機率,然後立刻冰浴,使孔收縮,進去的dna不要出來。個人想法,沒看到過類似文獻。
你在ncbi上查查第一個利用大腸桿菌轉化的人,他是怎麼做的。文獻裡肯定有原理說明,不過可能是幾十年前的文獻了。
5樓:浙大阿米巴
提高轉化率。
具體原理我不知道。
大腸桿菌感受態細胞轉化實驗中沒冰浴就熱擊會怎樣?
6樓:冰鋒
冰浴是為了質粒附著在菌體表面,熱擊是開啟通道讓質粒進入,覺得lz的做法影響不大,不過要實際驗證
轉化感受態細胞的目的是什麼轉化感受態細胞的前因後果
感受態細胞指的是經處理後,處於能吸收周圍環境中dna分子生理狀態的微生物細胞,在轉基因技術操作過程中要將重組dna分子匯入微生物受體細胞時就需要用感受態細胞。所謂轉化是目的基因進入受體細胞並在受體細胞中維持穩定和表達的過程。1 質粒dna的質量和濃度,環狀重組質粒的轉化率較分子量相同的線性重組質粒高...
凍融法制備農桿菌感受態細胞,並且轉化質粒相關問題
實驗結果 不能肯定來的說明結果是成功源 的,做bai實驗的陰性對照也很du重要,陰性zhi對照必須做出陰性結果。如樓dao下的所說,可能是你的感受態菌被質粒汙染了。現在我回答一下你的 追問吧 未轉化質粒的感受態細胞在同樣的lb上塗板也長出單菌落 那麼這個長出的單菌落你有沒有做菌落pcr的鑑定?如果你...
感受態細胞放了小時多才轉化,會對結果有影響嗎
放在4 冰箱內，問題不大 如果放在室溫下，那麼轉質粒 10kb以下 關係也不大，轉連線產物就有點不太好，因為感受態的效價至少下降兩個數量級左右 感受態細胞為什麼要放倒 80度儲存 康體生命的感受態細胞都是 80度儲存的，dh5 dh10 stbl3，jm109，bl21 de3 top10這些都是包...