1樓:匿名使用者
感受態細胞指的是經處理後,處於能吸收周圍環境中dna分子生理狀態的微生物細胞,在轉基因技術操作過程中要將重組dna分子匯入微生物受體細胞時就需要用感受態細胞。所謂轉化是目的基因進入受體細胞並在受體細胞中維持穩定和表達的過程。(1)質粒dna的質量和濃度,環狀重組質粒的轉化率較分子量相同的線性重組質粒高10~100倍,則會使轉化率下降;ml左右,且注意防止被其它試劑。
(應注意od600值與細胞數之間的關係隨菌株的不同而不同),大於30kb的重組質粒將很難進行轉化:所用的cacl2等試劑均需是最高純度的。對tg1菌株。
所有的試劑都要滅菌。對於以質粒為載體的重組分子而言: 用於轉化的質粒dna應主要是超螺旋態的,並經高壓滅菌處理,1ng的cccdna即可使50ul的感受態細胞達到飽和。
一般地。細胞生長密度以每毫升培養液中的細胞數在5×107個左右為佳,所用器皿,並用最純淨的水配製,細胞密度在5×107個/:整個操作過程均應在無菌條件下進行,分子量大的轉化效率低,移液槍頭等最好是新的,不能離開冰浴,重組dna分子的構型與轉化效率也密切相關,否則細胞轉化率將會降低,可通過測定培養液的od600控制、dna酶或雜dna所汙染,轉化率與外源dna的濃度在一定範圍內成正比。
密度過高或不足均會使轉化率下降。不要用已經過多次轉接。(二)感受態細胞轉化中的影響。
(2)感受態細胞的質量。整個操作均需在冰上進行,但當加入的外源dna的量過多或體積過大時,dna溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%,實驗證明,及貯存在4°C的培養菌液,因此重組dna大都構成環狀雙螺旋分子,最好分裝儲存於4°C (3)細胞的生長狀態和密度 最好從-70°C或-20°C甘油儲存的菌種中直接轉接用於製備感受態細胞的菌液。即應用對數期或對數生長前期的細菌,否則均會影響轉化效率或雜dna的轉入,od600為0.5時,如離心管
轉化感受態細胞的目的是什麼
2樓:匿名使用者
將構建好的載體轉入感受態細胞進行表達,不僅可以檢驗重組載體是否構建成功,最主要的是感受態細胞作為重組載體的宿主可以進行後續實驗,如蛋白質表達純化等工作
3樓:匿名使用者
因為細胞處於感受態是最容易轉入外源dna的時候,轉入之後的操作樓上已經說了~~
什麼叫感受態細胞?什麼叫轉化
4樓:匿名使用者
感受態細胞指的是經處理後,處於能吸收周圍環境中dna分子生理狀態的微生物細胞,在轉基因技術操作過程中要將重組dna分子匯入微生物受體細胞時就需要用感受態細胞。所謂轉化是目的基因進入受體細胞並在受體細胞中維持穩定和表達的過程。
目的dna與載體連線後轉化感受態細胞,但在固體培養基上未能長出菌落,試分析出現該情況的可能原因。 10
5樓:匿名使用者
沒有成功轉化
選錯了篩選培養基
感受態細胞在轉化前就已經失活了
感受態細胞轉化效率低的原因是什麼
6樓:北京索萊寶科技****
感受態細胞轉化效率的高低與哪些因素有關:
1.細菌的
生長狀態:實驗中應密切注視細菌的生長狀態和密度,儘量使用對數生長期的細胞(一般通過檢測od600來控制.dh5α菌株 od600為 0.5 時細胞密度是 5 × 107/ml );
2.所有操作均應在無菌條件和冰上進行;
3.經 cacl2處理的細胞,在低溫條件下,一定的時間內轉化率隨時間的推移而增加, 24小時達到最高,之後轉化率再下降(這是由於總的活菌數隨時間延長而減少造成的);
4.化合物及無機離子的影響:在 ca2+的基礎上聯合其他二價金屬離子(如 mn2+或 co2+)、 dmso 或還原劑等物質處理細菌,可使轉化效率大大提高,一般來講 cacl2 /cocl2法及二甲基亞碸(dmso)等可以提高轉化率很多倍(100-1000);
5.所使用的器皿必須乾淨.跡量的去汙劑或其它化學物質的存在可能大大降低細菌的轉化效率;
6.質粒的大小及構型的影響:用於轉化的應主要是超螺旋的 dna ;
感受態細胞轉化時,熱擊後需冷卻5分鐘的原因或者好處是什麼及原理?
7樓:阿魯巴星人
化轉時,感受態細胞膜由於吸附陽離子(ca2+等)呈液晶狀態,受到熱激後,細胞膜出現裂隙,外源dna進入細胞,此時細胞非常脆弱,將其冰浴冷卻,細胞膜修復閉合,進行下一步的復甦時細胞存活率將提高。
感受態細胞的製備及轉化平板上菌落的多少跟什麼原因相關
8樓:北京索萊寶科技****
感受態細胞的製備及轉化平板上菌落的多少主要與兩個方面有關:一是感受態的質量;二是質粒與感受態的比例(如果是連線產物.就要看連線效率的高低了)
大腸桿菌感受態細胞轉化實驗正負對照
轉化a.將 70 0c下保bai存的感受態細胞 du200 l 室溫下 zhi解凍後放置於冰上。dao b.將nd pucm t質粒dna溶液 不超過50ng 或回pcr產物與pucm t質粒的答連結產物,體積不超過10 l,輕輕搖勻,冰上放置30min。c.42 0c水浴中熱擊90s或370c水浴...
感受態細胞放了小時多才轉化,會對結果有影響嗎
放在4 冰箱內，問題不大 如果放在室溫下，那麼轉質粒 10kb以下 關係也不大，轉連線產物就有點不太好，因為感受態的效價至少下降兩個數量級左右 感受態細胞為什麼要放倒 80度儲存 康體生命的感受態細胞都是 80度儲存的，dh5 dh10 stbl3，jm109，bl21 de3 top10這些都是包...
凍融法制備農桿菌感受態細胞,並且轉化質粒相關問題
實驗結果 不能肯定來的說明結果是成功源 的,做bai實驗的陰性對照也很du重要,陰性zhi對照必須做出陰性結果。如樓dao下的所說,可能是你的感受態菌被質粒汙染了。現在我回答一下你的 追問吧 未轉化質粒的感受態細胞在同樣的lb上塗板也長出單菌落 那麼這個長出的單菌落你有沒有做菌落pcr的鑑定?如果你...