1樓:匿名使用者
因為感受態細胞本來就不具備抗性。
後期用載體質粒轉化感受態細胞時,我們就是回根據 轉化成功的答大腸桿菌(載體質粒進入該感受態細胞)能在含抗生素的培養基上生長 而轉化不成功(載體質粒沒有進入感受態細胞)的感受態細胞則由於沒有抗性而不能生長 這一原理來判斷是否轉化成功。
2樓:匿名使用者
de3就是bl21吧。沒聽說這個菌株自身帶抗性啊。
為什麼大腸桿菌感受態細胞製備和轉化
3樓:元霜
轉化實驗用bai液態的lb是為了讓細du胞恢復培
zhi養,也有人稱
之為讓其孵育,質dao粒或其他經專在液態lb中恢復屬培養後再塗布平板(固態培養基),是為了分散開,以培養單克隆。一般經37度倒置培養12-16h後,就可以看到有單個克隆長出,就可挑取了。
感受態細胞的製備時有什麼注意事項
4樓:置嚼勒眯
方法一:細菌轉化的方法多以mendel和higa(1970)的發現為基礎,其基本方法是用冰預冷的cacl2或多種2價陽離子等處理細菌,使之進入感受態得以轉化。用cacl2製備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞,常用於成批製備感受態細菌。
本法適用於大多數大腸桿菌菌株,且迅速、重複性好。操作過程簡述如下。1.從37°C培養16~20h的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌dh52),或1ml新鮮的16~20h過夜培養物,轉到一個含有100mllb培養基的1l或500ml燒瓶中。
於37°C劇烈振搖培養約2~3h(旋轉搖床200~300r/min),每隔20~30min測量od600值≈0.4。2.在無菌條件下將細菌轉移到一個,用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中,在冰上放置10~20min。
3.於4°C用sorvallgs2轉頭(或與其離心管相配的轉頭)以4000r/min離心10min,以**細胞。4.倒數培養液,將管倒置1min以使最後殘留的痕量培養液流盡。5.以10ml用冰預冷的0.
1mmcacl2重懸每份沉澱,放於冰上。6.於4°C用sorvallgs3轉頭(或與其相應的轉頭)以4000r/min離心10min,以**細胞。7.倒出培養液,將管倒置1min以使最後殘留的痕量培養液流盡。
8.每50ml初始培養物用2ml冰預冷的0.1mcacl2重懸每份沉定,此時,可以迅速將細胞分裝成小份,液氮中冰凍,-70°C貯存備用。9.用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中,每管加dna或連線反應混合物(體積≤10μl,dna≤50ng),輕輕旋轉以混勻內容物,在冰中放置30min。
10.將離心管放到預加溫到40°C的迴圈水浴中的試管架上,放置90s~2min,不要搖動試管。11.快速將管轉移到冰浴中,使細胞冷卻1~2min。12.每離心管加800μlsoc培養基,用水浴將培養基加溫到37°C,然後將管轉移到37°C搖床上,溫育45min使細菌復甦,並且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。
13.將適當體積(每個90mm平板可達200μl)已轉化的感受態細胞轉移到含200mmol/lmgso4和相應抗生素的sob培養基上。14.將平板置於室溫至液體被吸收。15.倒置平皿,於37°C培養,12~16h後可出現菌落。
方法二:cassuperone-step***petentcellprepskit採用一種簡單便捷的方法處理大腸桿菌,使其成為感受態細胞,便於質粒dna的轉化,可滿足一般實驗的要求。與cacl2法相比具有多種優點:
使用方便,只需一步即可完成感受態細胞的製備;轉化效率略高於cacl2法,一般可達106-108cfu/μg,滿足一般實驗需要;感受態細胞製成後即可儲存於-70°C,無須加入甘油,並且經長期儲存活力無明顯下降。準備工作:1.從液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌凍存菌,在lb平板上劃線,37度過夜至長出單菌落。
挑形態飽滿的單菌落2個,分別接種5mllb培養基中,37°C,250rpm,過夜培養。2.次日從5mllb培養物吸取200μl轉入50mllb培養基中(250ml錐形瓶),37°C,250rpm培養2小時,此時od600約0.4—0.
5。感受態細胞的製備:3.吸取1ml菌液到1.
5ml離心管裡,5000rpm離心5分鐘,棄去上清。4.加入100μl預冷的solutiona,懸浮菌體,冰浴30分鐘。5.此時感受態細胞已經制成可立即使用或-70°C儲存。
細胞轉化:6.在感受態細胞中加入100pg-10ngdna,混勻,冰浴30分鐘,然後42°C1分鐘熱擊,再次冰浴2分鐘。加入0.
9mllb培養基,20μlsolutionb,37°C,振盪培養1小時。7.取適當菌液(100-200μl)塗布相應抗性的平板。8.過夜培養約16個小時,數菌落數,計算轉化率。
補充說明:1.所用器具一定要清潔;2.操作步驟2中培養基的裝量也是很重要的,建議裝量不要高於此值:500ml錐形瓶裝100ml培養基,250ml錐形瓶裝50ml培養基;3.在收穫菌體前半小時還可以在培養基中加入20mm的mgcl2,效果會更好一些;4.為保證細胞處於對數生長期,培養後的菌體的od值不要高於0.
6;5.製備感受態細胞時所有操作儘量保證在冰上操作;6.細胞轉化操作步驟6中也可以不必進行熱擊,冰浴後直接加入新鮮lb,簡化操作步驟,但轉化效率低於熱擊方法,適用於對轉化率要求不高的實驗。方法三:1、取1%大腸桿菌e.
coli接種於含2mllb培養基的試管中,37°C振盪培養過夜2、取0.1ml過夜培養物轉種於含10mllb培養基的三角瓶中,37°C振盪培養3h至od600=0.3ml離心管中,冰浴10min。
4、在4°C下以4000rpm離心5min,去上清液5、把菌體懸浮於15m1冰冷的0.1mcacl2溶液中,置冰上30min6、然後再在4°C下以4000rpm離心10min,去上清液7、將菌體懸浮於0.1mlcacl2溶液中,冰浴放置4-12hr備用。
方法四:(1)將1ml過夜培養的細菌(如dh52、tg1、tm101)接種於100ml2×yt培養於500ml燒瓶。於37°C刷烈振盪,通常≥200rpm培養的細菌密度約od550=0.
2~0.5(5×107cells/ml),需2~4h。(2)將培養物放於冰上致冷10min,於4°C離心細菌培養物,10000rpm離心10min。
(3)棄除上清,將細菌懸浮於原始培養體積的一半(約50ml)的50mmcacl2和10mmtris·hcl(ph8.0)無菌冷凍液體中。(4)將細菌懸浮放在冰上約5min,然後將懸浮物於4°C10000/rpm離心10min。
(5)棄上清,懸浮細菌於原始培養體積的1/15的50mmcacl和10mmtris·hcl(ph8.0)無菌冷凍中。此時的細胞是感受態細胞,即可用於轉化。
200μl分裝於無菌的1.5ml微量離心管中,貯存於-80°C冰箱中。方法五:
tsb法(也是本人熱衷的方法)1.藥品製備1mmg2+(1mmgso4和1mmgcl2等體積混合),用0.22um濾膜超濾除菌。
tsb液(30ml/80ml菌液)(現配現用):peg33503gtryptone0.3gyeastextract0.
15gnacl0.3g2.步驟:
(1)活化菌株(2)挑單菌落培養於5ml的液笨培養基中(3)取液體培養物50ul於80ml的液體培養基中進行擴大培養(4)370c培養3-4小時,od600在0.4-0.6(5)離心,去上清(6)加入20mltsb,重懸(7)離心,去上清(8)加入10mltsb,再加入15-20%的甘油,分裝儲存注,整個操作過程均應在冰上進行。
所用藥品均需滅菌。轉化程式(1)取出200μl感受態細胞慢慢使其溶化,並立即放於冰上,加入dna或連線反應混合物,dna量通常≤50mg。用手指彈打試管10次,使之混勻,然後放在冰上40~45min。
(2)將管放於42°C水浴中2min。(3)然後每管直接加入1.0ml2×yt培養基,倒置混勻,並於37°C培養8~12h,幹浴或水浴,不需振搖。
此期間使細菌生長並開始表達抗菌素。(4)每200μl轉化混合物分別於6個2×yt瓊脂培養板上補充相應抗生素,並含有x-gal(20mg/ml)、iptg(200mg/ml)。
大腸桿菌感受態細胞製備為什麼要用cacl2處理細菌
5樓:阿魯巴星人
ca離子沉聚在細胞膜表面會使得細胞膜呈一種液晶的狀態,這種狀態便於在熱激條件下形成縫隙,便於轉化質粒。
如何製備大腸桿菌感受態細胞
6樓:匿名使用者
(1)挑取大腸桿菌單菌落,接種於5 ml無抗生素的lb液體培養基中,37°C下振盪培養13h,至對數生長後期。將該菌懸液以1:50 的比例接種於100 ml lb 液體培養基中,37°C振盪培養2-3h至od600=0.
5。(2)在無菌條件下將培養液轉入離心管中,冰上放置10 min,使培養物冷卻至0°C,然後4°C,4000rpm離心10min;
(3)棄去上清,倒置1 min,以便將培養液流盡;
(4)用冰預冷的0.1 mol/l的cacl2溶液10 ml輕輕懸浮細胞,充分混勻,冰上放置30 min後,4°C下4000rpm離心10min;
(5)棄去上清,並倒置1 min,以便最後的痕量培養液流盡;
(6)加入4 ml預冷含15%甘油的0.1 mol/l的cacl2溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液;
(7)感受態細胞100 μl分裝,貯存於-70 °C儲存備用。
大腸桿菌感受態細胞轉化實驗正負對照
轉化a.將 70 0c下保bai存的感受態細胞 du200 l 室溫下 zhi解凍後放置於冰上。dao b.將nd pucm t質粒dna溶液 不超過50ng 或回pcr產物與pucm t質粒的答連結產物,體積不超過10 l,輕輕搖勻,冰上放置30min。c.42 0c水浴中熱擊90s或370c水浴...
大腸桿菌的轉化原理及方法，大腸桿菌轉化除了感受態細胞轉化方法外，還有哪些方法
所謂的轉化是將外源dna分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳 分子遺傳 基因工程等研究領域的基本實驗技術。在自然條件下，很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內，但在人工構建的質粒載體中，一般缺乏此種轉移所必需的mob基因，因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合...
對大腸桿菌敏感的抗生素有哪些,對大腸桿菌敏感的抗生素有哪些
有很多種,卡納黴素 慶大黴素,沙星利菌沙等等一類。抗菌優,卡那黴素,恩諾沙星等。大腸桿菌對抗生素的敏感性如何 它們都屬於氨基糖抄 苷類類抗生bai素,對革蘭氏陰性菌都du 有較強的作用。一 鏈zhi 黴素 抗菌譜及臨dao床應用 1.對結核 鼠疫桿菌作用強 各型結核 鼠疫 兔熱病 2.對革蘭氏陰性桿...