1樓：匿名使用者
最簡單的就是用現有的載體就行改建，除非你自己做表達載體優化，一般實驗室都是用現成的載體，匯入目的片段那樣做得！真核表達載體就是多一個轉移片段，原理都是一樣的！
急，如何構建原核表達載體
2樓：匿名使用者
大體分為一下幾步
bai：
1.設計目du的片段引
zhi物（含限制性酶切位點dao，要求：表達載體上有內而目的容片段上沒有的酶切位點）
2.pcr擴增片段
3.擴增後的片段與pmd18/19t克隆載體連線，通過藍白斑篩選，提質粒並酶切鑑定；將正確連線的克隆載體重組質粒酶切，**目的片段
4.目的片段與表達載體連線
5.轉化到dh5a等克隆菌株，通過抗生素篩選，鑑定表達重組質粒。
6.測序檢測
7.正確的表達重組質粒再轉到表達菌株
8.表達
3樓：匿名使用者
就把重組基因匯入到原核細胞dna裡
如何構建某一個基因的原核表達載體
4樓：匿名使用者
構建表達載復體首先取決於你的實驗目制的，例bai如你的實驗是du否要求你的蛋白表達zhi出來必須可溶性蛋白，dao載體上面的標籤決定了你的純化方法，當然也決定了實驗成本，等等一系列需求。
拿帶標籤的載體為例，因為帶標籤後可以增加蛋白質的可溶性，也為純化帶來了方便，一般都會採用。標籤一般都是在目的蛋白的n端，這樣就需要考慮讀碼框的問題，一定要與前面的讀碼框保持一致。
利用酶切連線的方法連入目的載體這個應該都知道，或者用gateway系統，非常方便，我就經常用gateway載體，構建起來速度呼呼的。
基本就是這些了吧，主要就考慮選擇什麼標籤和讀碼框別錯了。
有什麼問題可以直接發信給我
如何構建一個基因的過表達載體？是要真核表達的
5樓：順反子
該答案來自來自，**在下面，僅供參考。
引物設計需要注意的地方很多，在大多數情況下，我們都是在知道已知模板序列時進行pcr擴增的。
設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。引物分析軟體將試圖通過使用每一引物設計變化的預定值在這兩個目標間取得平衡。設計引用有一些需要注意的基本原理：
① 引物長度
一般引物長度為18~30鹼基。總的說來，決定引物退火溫度（tm值）最重要的因素就是引物的長度。有以下公式可以用於粗略計算引物的退火溫度。
在引物長度小於20bp時：[4(g+c)+2(a+t)]-5℃
在引物長度大於20bp時：62.3℃+0.41℃(%g-c)-500/length-5℃
另外有許多軟體也可以對退火溫度進行計算，其計算原理會各有不同，因此有時計算出的數值可能會有少量差距。為了優化pcr反應，使用確保退火溫度不低於54℃的最短的引物可獲得最好的效率和特異性。
引物長度的上限並不很重要，主要與反應效率有關。由於熵的原因，引物越長，它退火結合到靶dna上形成供dna聚合酶結合的穩定雙鏈模板的速率越小。
② gc含量
一般引物序列中g+c含量一般為40%~60%，一對引物的gc含量和tm值應該協調。若是引物存在嚴重的gc傾向或at傾向則可以在引物5』端加適量的a、t或g、c尾巴。
③ 退火溫度
退火溫度需要比解鏈溫度低5℃，如果引物鹼基數較少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使pcr的特異性增加；如果鹼基數較多，那麼可以適當減低退火溫度，是dna雙鏈結合。一對引物的退火溫度相差4℃～6℃不會影響pcr的產率，但是理想情況下一對引物的退火
溫度是一樣的，可以在55℃～75℃間變化。
④ 避免擴增模板的二級結構區域
選擇擴增片段時最好避開模板的二級結構區域。用有關計算機軟體可以**估計目的片段的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△g）小於58.
6lkj/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2』-脫氧gtp取代dgtp對擴增
的成功是有幫助的。
⑤ 與靶dna的錯配
當被擴增的靶dna序列較大的時候，一個引物就有可能與靶dna的多個地方結合，造成結果中有多個條帶出現。這個時候有必要先使用blast軟體進行檢測，
6樓：撒麼
基因表達載體的構建（即目的基因與運載體結合）是實施基因工
程的第二步，也是基因工程的核心。 將目的基因與運載體結合的過程，實際上是不同**的dna重新組合的過程。如果以質粒作為運載體， 首先要用一定的限制酶切割質粒，使質粒出現一個缺口，露出黏性末端。
然後用同
一種限制酶切斷目的基因，使其產生相同的黏性末端（部分限制性內切酶可切割出平末端，擁有相同效果）。將切下的目的基因的片段插入質粒的切口處，首先鹼基互補配對結合，兩個黏性末端吻合在一起，鹼基之間形成氫鍵，再加入適量dna連線酶，催化兩條dna鏈之間形成磷酸二酯鍵，從而將相鄰的脫氧核糖核酸連線起來，形成一個重組dna分子。如人的胰島素基因就是通過這種方法與大腸桿菌中的質粒dna分子結合，形成重組dna分子（也叫重組質粒）的。
7樓：匿名使用者
首先需要你瞭解你需要的真和表達載體的各方面是不是符合你的要求，一定要有mcs位點，然後對你要進行表達的基因測序並根據序列設計引物，因為要重組到載體上，所以你要在引物兩端各加上你所要用的限制酶的識別序列，這樣就可以重組上去了，如果只用一種酶切的話就要注意連線的方向了，如果是兩種酶的話就沒事了，對於過表達，你得根據你自己的研究物件來對基因就行修改，但重組的方法就不變。
原核表達載體和真核表達載體的區別
8樓：威海博銳化機
一、表達載體不同：
原核表達載體構建重組表達載體：
1、載體酶切：將表達質粒用限制性內切酶（同引物的酶切位點）進行雙酶切，酶切產物行瓊脂糖電泳後，用膠**kit或凍融法**載體大片段。
2、pcr產物雙酶切後**，在t4dna連線酶作用下連線入載體。
真核細胞表達載體之一為pegfp-n1載體，具有對方面的優點。pegfp-n1載體上攜帶有egfp蛋白表達基因。
二、表達實現方式不同：
真核表達載體具有neo基因，可以採用g418來篩選已成功轉染了該載體的靶細胞。這些特殊的結構可以實現目的基因在靶細胞內的穩定表達。
三、獲得目的基因方式不同：
pegfp-n1載體從結構上看，質粒具有很強的複製能力，可以滿足隨宿主細胞**時跟隨胞質遺傳給新生的子細胞，這是真核細胞表達載體保證目的基因穩定表達的因素之一。
原核表達載體獲得目的基因：
1、通過pcr方法：以含目的基因的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），pcr迴圈獲得所需基因片段。
2、通過rt-pcr方法：提取總rna，以mrna為模板，逆轉錄形成cdna第一鏈，以逆轉錄產物為模板進行pcr迴圈獲得產物。
9樓：匿名使用者
原核載體可以將真核基因表達，但是表達出來的蛋白是沒有活性的，因為缺少翻譯後修飾系統。。。真核的表達載體呢 由於比較大 不適合大量快速擴增，所以要在其載體上構建可以在原核生物 如大腸桿菌中複製的所需的複製原件 。。。。綜上 在應用的時候 要構建 穿梭質粒 可以穿梭於 原核和 真核 呵呵 還有就是 原核表達載體的基本元件和真核的有不同的地方 。。。。。
總覺得不夠正確答案 。。。。。有些人緣的蛋白在原核裡沒有蛋白翻譯後修飾，表達後沒有活性，這時候就得在真核裡表......
10樓：匿名使用者
主要是因為原核和真核表達系統所需的表達元件不同。
比如說啟動子，終止子在兩種表達系統中是不一樣的。
帶有真核表達元件的是真核載體，能在真核生物內表達；
帶有原核表達元件的是原核載體，能在原核生物內表達。
兩者都具有的為穿梭載體。
1)真核表達載體和原核表達載體就是能在真核生物或原核生物中表達的載體,它們一般都帶有能在真核生物或原核生物中表達的必需表達元件;
2)真核表達和原核表達的目的都是為了能夠大量獲得自己所需要的目的基因的表達產物,最好有生物活性,以便下一步的實驗需要.
3)原核表達載體一般只能在原核生物中表達外源基因,但有些穿梭載體可以分別在真核和原核生物中表達它們的表達元件.
為什麼構建的真核表達載體在真核細胞中不表達
11樓：匿名使用者
有的時候在不同的表達體系裡面對蛋白的表達量是有影響的。當構建完成後攜帶有訊號肽的時候，一些蛋白在真核表達體系中表達量極低。去除訊號肽序列值後，直接表達成熟肽，表達水平明顯提高。
所以說構建的真核表達載體高表達mrna卻檢測不到目的蛋白是完全有可能的。
12樓：匿名使用者
是在真核生物細胞中的基因表達載體的元件麼？如果是，元件是啟動子，終止子，複製原點，目的基因，標記基因
原核載體與真核載體
13樓：匿名使用者
主要是因為原抄核和真核表達襲系統所需的表達元件不同。
比如說啟動子，終止子在兩種表達系統中是不一樣的。
帶有真核表達元件的是真核載體，能在真核生物內表達；
帶有原核表達元件的是原核載體，能在原核生物內表達。
兩者都具有的為穿梭載體。
1)真核表達載體和原核表達載體就是能在真核生物或原核生物中表達的載體,它們一般都帶有能在真核生物或原核生物中表達的必需表達元件;
2)真核表達和原核表達的目的都是為了能夠大量獲得自己所需要的目的基因的表達產物,最好有生物活性,以便下一步的實驗需要.
3)原核表達載體一般只能在原核生物中表達外源基因,但有些穿梭載體可以分別在真核和原核生物中表達它們的表達元件.
14樓：_寧韓飄雪
是載體的區別…一個是原核細胞裡得到的，一個是真核…
15樓：匿名使用者
載體指的是基因工程中的載體嗎?
為什麼要先構建克隆載體再用表達載體
構建克隆載體是大量擴增dn 段，用以測序 酶切和改造等對dna實施的後續操作，構建表達載體是大量得到翻譯產物 蛋白質。為什麼要先構建克隆載體，再用表達載體，我猜是因為 得到大量的dna，雖然pcr也可以，但pcr擴增有出錯率 但你每做一次常規的pcr，而且每次都要重新提dna和rna才行，而且，pc...
原核表達載體和真核表達載體的區別
一 表達載體不同 原核表達載體構建重組表達載體 1 載體酶切 將表達質粒用限制性內切酶 同引物的酶切位點 進行雙酶切，酶切產物行瓊脂糖電泳後，用膠 kit或凍融法 載體大片段。2 pcr產物雙酶切後 在t4dna連線酶作用下連線入載體。真核細胞表達載體之一為pegfp n1載體，具有對方面的優點。p...
真核表達載體和原核表達載體的區別
原核bai載體可以將真核基因表達，du 但是表達出zhi來的蛋白dao 是沒有活性的，因專為缺少翻譯後修飾系統屬。真核的表達載體呢由於比較大 不適合大量快copy速擴增，所以要在其載體上構建可以在原核生物如大腸桿菌中複製的所需的復知制原件 綜上 在應用的時候 要構建穿梭質粒 可以穿梭於 原核和真核 ...